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技術(shù)文章

流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟

閱讀：228發(fā)布時(shí)間：2016-3-16

一、收集細(xì)胞
 
收集細(xì)胞｛數(shù)目約（1~ 5）×106個(gè)/mL｝，500~ 1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。
 
二、細(xì)胞洗滌
 
3 ml PBS洗滌1次。
 
三、乙醇固定
 
離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1-2小時(shí)。
 
四、細(xì)胞重懸
 
離心棄去固定液，3 mlPBS重懸5 min。
 
五、細(xì)胞過(guò)濾
 
400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次，500-1000 r/min離心5 min，棄去PBS。
 
六、染色
 
用1 ml PI染液染色，4℃避光30 min。
 
七、流式細(xì)胞儀檢測(cè)
 
PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。
 
八、結(jié)果判斷
 
在前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類型有關(guān)；在分析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強(qiáng)度為1.0，則一個(gè)典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45，可用雞和鮭魚(yú)的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。


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