一些淋巴細(xì)胞，如CTL、NK、LAK等對靶細(xì)胞具有直接的殺傷作用，可以根據(jù)待檢測的效應(yīng)細(xì)胞的性質(zhì)選用相應(yīng)的靶細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、移植供體細(xì)胞等，可用于腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)、病毒感染等方面的研究。免疫效應(yīng)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)是在組織培養(yǎng)中研究淋巴細(xì)胞、抗體或抗體依賴性淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的一種技術(shù)，也是在體外研究特異性細(xì)胞免疫比較可靠和靈敏的方法，檢測方法有形態(tài)法、放射性同位素法、乳酸脫氫酶釋放法、MTT法、流式細(xì)胞儀法等。

一、形態(tài)學(xué)檢測法(以CTL為例)

(一)原理

    形態(tài)學(xué)檢查法是根據(jù)體外貼壁生長的靶細(xì)胞被CTL殺傷后失去貼壁的能力，所以從貼壁細(xì)胞數(shù)目減少情況可判斷CTL殺靶細(xì)胞的能力。形態(tài)學(xué)方法不需要特殊設(shè)備，僅用顯微鏡計(jì)數(shù)靶細(xì)胞的存活數(shù)，操作方便。

(二)材料

1．新鮮的外周(肝素)抗凝血液。

2．靶細(xì)胞(通常選用傳代的腫瘤細(xì)胞如K562)。

3．RPMI 1640培養(yǎng)液、PBS緩沖液。

4．96孔酶聯(lián)免疫塑料板、微量試驗(yàn)板。

(三)方法

1．靶細(xì)胞的接種用RPMI 1640培養(yǎng)液將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物制成懸液，并稀釋1×103／ml的細(xì)胞濃度。于微量試驗(yàn)板的小孔內(nèi)分別接種O．1 ml腫瘤細(xì)胞(內(nèi)含1。。個細(xì)胞)，5％CO 237℃孵箱培育24h。細(xì)胞貼壁后，輕輕棄去培養(yǎng)基，加1ml PBS洗滌，輕去洗滌液及未貼壁細(xì)胞。

2．淋巴細(xì)胞分離液制備PBMC

(1)將4ml分層液置試管下層，然后將抗凝血(1ml靜脈血與1ml肝素混勻，再用Hank’s液對倍稀釋)輕輕鋪于分層液上，使分層良好。

(2)用水平離心機(jī)2000r／min離心20min，用毛細(xì)吸管將單個核細(xì)胞吸出，并用Hank’s液洗滌3次，每次1500r／min離心10min，取懸液0．1ml加等量血細(xì)胞稀釋液，計(jì)數(shù)，zui后配成(2～4)×105／ml的細(xì)胞懸液。

3．細(xì)胞毒性反應(yīng)

(1)淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)：向小孔分別加入0．2ml不同濃度的淋巴細(xì)胞(分別含有5×105，5×lO4，5×lO3)，使淋巴細(xì)胞與癌細(xì)胞之比依次為1000：l、l00：1、lO：1。

(2)每小孔補(bǔ)加含20％NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液O．1ml，5%CO237℃孵箱培育2～3d。

(3)2％臺盼藍(lán)染色，翻轉(zhuǎn)微量試驗(yàn)板，計(jì)數(shù)活存的腫瘤細(xì)胞，并設(shè)正常人淋巴細(xì)胞代替腫瘤患者淋巴細(xì)胞作對照，每份需同時做3個復(fù)孔，分別檢查各孔中存活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各孔平均殘留細(xì)胞數(shù)，便可求出淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率(即細(xì)胞毒性)。

(四)結(jié)果分析

    鏡檢計(jì)數(shù)每孔底殘留的細(xì)胞數(shù)，以抑制率表示。