1.氟化鈉、釩酸鈉和焦磷酸鹽經(jīng)常用做磷酸酶抑制劑，而*抑制劑、亮肽酶素和苯甲基磺酰氟化物用做蛋白酶抑制劑。這種緩沖液里所用的抑制劑全部具有一定程度的毒性，使用時應(yīng)該小心操作。這些抑制劑可能不足以抑制所有蛋白的酶修飾，同時如果不需要的話也可將它們?nèi)コ蛱娲?/p>

2.ProteinA是一個葡萄球菌屬的蛋白，它結(jié)合到抗體分子的保守位置，親和力決定于種屬和抗體的類型。有一個類似ProteinA的分子是ProteinG，可以用于不同的抗體類型。一個實用的選擇規(guī)律是將Pro-teinA用于兔來源的抗體，而ProteinG用于鼠來源的抗體。在本章中，PAS可以是ProteinASepharose或 ProteinGSepharose。

3.除了用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，還可以用細(xì)胞系或組織表達(dá)的內(nèi)源蛋白做免疫共沉淀。這樣做的優(yōu)勢是避免了過表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，并且消除了外來的接頭和標(biāo)簽序列。然而，這類免疫共沉淀實驗將更加困難，因為需要細(xì)胞表達(dá)足夠多的內(nèi)源性目標(biāo)蛋白才能滿足高質(zhì)量抗體的需要，并且實驗中缺乏好的陰性對照。本章列出的免疫沉淀過程可以作為一個實驗起始點，但是各種來源的細(xì)胞裂解物、各種抗體以及與種屬和匹配類型不相關(guān)的抗體應(yīng)該被提前檢測是否能與感興趣蛋白發(fā)生特異性的相互作用。此外，如果蛋白相互作用可能被藥物的刺激或細(xì)胞的培養(yǎng)條件影響，那么應(yīng)該在免疫共沉淀實驗中加以驗證。

4.這個方法中常用HEK293細(xì)胞，因為這種細(xì)胞易于培養(yǎng)并且轉(zhuǎn)染效率高。如果需要也可使用其他合適的細(xì)胞系。

5.除了數(shù)細(xì)胞個數(shù)，也可以用裂解物做蛋白濃度測量。如果樣品量大，這種做法非常方便。在免疫共沉淀時，用一種樣品的大約一半裂解物來作為其他樣品的等量對照，這樣各組容易獲得平均的蛋白量。

6.由于PAS的相對惰性以及Westernbloting對目標(biāo)蛋白特異的檢測意味著在很多情況下，預(yù)清除步驟并不是必須的。為了節(jié)約時間和成本，實際實驗中經(jīng)常將這步省略。但在*次嘗試一個特殊的免疫共沉淀時加上這步。

7.方法中列出的抗體和PAS的用量與細(xì)胞裂解物的量高度相關(guān)。這些量的選擇應(yīng)該能夠zui大程度地沉淀誘餌蛋白。注意，大量的PAS更加容易沉淀復(fù)合體并能減少因為少量 PAS珠子流失所造成的影響。但是，這些試劑非常昂貴，所以在很多情況下可以盡量減少抗體和PAS的用量，用量對于不同系統(tǒng)有很大差異，應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗選擇。

8.處理PAS應(yīng)該注意一些技術(shù)。因為緩沖液可能會揮發(fā)，所以在從儲存瓶中取PAS珠子之前，應(yīng)該先將瓶子平放并確認(rèn)有幾乎等量的珠子和儲存緩沖液。如果儲存緩沖液變少了應(yīng)該加入更多的儲存緩沖液（見包裝內(nèi)描述）。在吸取懸濁液時，用開口較大的tip頭或?qū)ip頭末端用刀片切掉。注意，離心很容易將PAS破壞，因此一定要用低速或者短時離心。在洗滌過程中，注意不要吸到珠子，也不要讓珠子干透。zui后，一次只準(zhǔn)備足夠一次實驗的珠子，因為珠子長時間儲存在裂解緩沖液中會降低它與抗體的結(jié)合能力。

9.Westernblotingzui常用的IgG抗體是由兩條重鏈（大約50kD）和兩條輕鏈（大約25kD）組成的異源二聚體，重鏈與輕鏈依靠二硫鍵相連。當(dāng)煮沸PAS收集感興趣的蛋白復(fù)合物時，大多數(shù)抗體將一起從珠子上洗脫，造成zui終樣品中有大量抗體蛋白污染。如果洗脫液中含有還原劑，抗體將幾乎都以50kD和25kD的條帶存在；如果沒有，它們將主要出現(xiàn)在150kD但是50kD和25kD蛋白依然非常顯著。這就成為標(biāo)記Westernbloting的一個問題，因為Western的二抗通常是與過氧化物相連的抗IgG。如果免疫沉淀中的俘獲抗體和Western檢測用的一抗是同一種屬，被洗脫下來的俘獲抗體也能被二抗識別，這將產(chǎn)生非常強的干擾信號，因此免疫沉淀中的俘獲抗體和Western檢測的一抗應(yīng)該選擇不同種屬的抗體。即使這樣，與抗體成分分子量相近的蛋白可能造成干擾，因為Western的二抗經(jīng)常對不同種屬的IgG產(chǎn)生交叉反應(yīng)。如果這個問題無法通過在洗脫液中加入或去除還原劑來克服，另外可能的解決辦法一是跑長一些PAGE膠使感興趣的蛋白與俘獲抗體在物理上分離，二是用共價交聯(lián)在珠子基質(zhì)上的俘獲抗體。