通過(guò)使用免疫方法測(cè)定抗原和抗體間的結(jié)合，可以檢測(cè)出溶液中抗原和抗體的濃度。臨床實(shí)驗(yàn)室zui常用的免疫測(cè)定技術(shù)可以分為兩類(lèi)。*類(lèi)是敏感度相對(duì)來(lái)說(shuō)不那么高的技術(shù)，它包括以光散射和凝膠沉淀為原理的方法，這些方法中，抗體和抗原結(jié)合后發(fā)生生物物理學(xué)變化，然后產(chǎn)生信號(hào)（如形成沉淀）。第二類(lèi)技術(shù)包括RIA、EIA、熒光免疫測(cè)定和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定，在檢測(cè)抗體與抗原間的結(jié)合時(shí)，這些方法需要用放射性核素，酶，熒光或能發(fā)光的分子修飾抗原或抗體試劑。不論哪一種技術(shù)，為定量檢測(cè)濃度而轉(zhuǎn)換結(jié)合信號(hào)時(shí)都要求使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，加的是已知量的反應(yīng)物。
使用光散射來(lái)檢測(cè)單克隆抗體與可溶性抗原的結(jié)合就說(shuō)明了這個(gè)原理。6抗原和抗體在溶液中相互作用后形成分子復(fù)合物，該復(fù)合物比兩種反應(yīng)物的分子量都要大。光散射強(qiáng)度與分子量的平方成比例，7可以把抗原抗體復(fù)合物的形成描述為有更多的光散射，而不是由各蛋白質(zhì)產(chǎn)生的光散射的總和。例如，將含單克隆抗體的溶液放置于比濁計(jì)中，然后加入遞增量的抗原?？乖?抗體復(fù)合物產(chǎn)生光散射的增量比抗原抗體單獨(dú)產(chǎn)生的光散射要大。光散射圖的轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)在抗原與抗體的克分子濃度比等于2的地方。在這一點(diǎn)，抗體與抗原的反應(yīng)達(dá)到飽和，因?yàn)槊總€(gè)IgG抗體分子都有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。低于飽和點(diǎn)的任何一處，都有一個(gè)*的光散射信號(hào)與抗原濃度相對(duì)應(yīng)。用已知濃度的抗原溶液可以得到光散射信號(hào)的強(qiáng)度，進(jìn)而得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果檢測(cè)一個(gè)未知的標(biāo)本，產(chǎn)生一個(gè)光散射信號(hào)y，那么從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可定義出抗原的濃度等于x。所有的定量免疫測(cè)定都遵循下列原則。那就是（1）抗原-抗體復(fù)合物的量與被結(jié)合的抗原量成比例，（2）信號(hào)（如光散射）與抗原抗體復(fù)合物的量成比例，（3）用已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)，（4）用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)把信號(hào)轉(zhuǎn)換成濃度檢測(cè)。

實(shí)踐中，本例描述的散射光信號(hào)很小以致于它僅用于檢測(cè)純化的單克隆抗體和純化的抗原之間的結(jié)合作用。血清中別的蛋白質(zhì)的散射光背景會(huì)掩蓋抗原-抗體復(fù)合物的散射光。抗體與抗原結(jié)合后會(huì)出現(xiàn)內(nèi)在的變化，因此，大多數(shù)以此為原理的免疫測(cè)定方法都會(huì)使用多克隆抗血清，并以抗原-抗體的沉淀反應(yīng)為原理。因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗原都有好幾個(gè)可以被抗體識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，大多數(shù)抗血清也含有好幾種可以識(shí)別同一抗原分子不同結(jié)構(gòu)的抗體。因此，在典型的抗原-抗體反應(yīng)中，一個(gè)單獨(dú)的抗原可以有很多的抗體結(jié)合到它的表面。由于每種抗體分子都有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，那么與*個(gè)抗原結(jié)合的抗體都可以再與另一個(gè)相同的抗原結(jié)合，而每個(gè)抗原分子又可能有許多的抗體與之結(jié)合。這種交叉結(jié)合（或交叉連接）的現(xiàn)象導(dǎo)致了大量的不可溶的抗原抗體復(fù)合物的形成，該復(fù)合物叫晶格。晶格的形成是由于抗體雙價(jià)的結(jié)合結(jié)構(gòu)以及抗原多結(jié)合位點(diǎn)的出現(xiàn)?？乖^(guò)量時(shí)，抗體被飽和，沒(méi)有足夠的抗體與復(fù)合物交叉連接?？贵w過(guò)量時(shí)，抗原被抗體飽和，沒(méi)有足夠的抗原與復(fù)合物交叉連接。使用單克隆抗體而不是多單克隆抗血清時(shí)，每個(gè)抗原只能與一個(gè)單獨(dú)的位點(diǎn)結(jié)合，不會(huì)有交叉連接（或晶格形成）出現(xiàn)。

沉淀反應(yīng)是zui早被描述的抗原抗體反應(yīng)之一。8.9可以在某種介質(zhì)如瓊脂里進(jìn)行反應(yīng)，瓊脂允許蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散或電泳但大的，不溶性的抗原-抗體復(fù)合物卻不行。以瓊脂為基礎(chǔ)，zui常用的定量免疫化學(xué)技術(shù)是放射免疫擴(kuò)散（RID）。10 RID是zui簡(jiǎn)單可靠的免疫測(cè)定技術(shù)之一，但它也有有一些缺點(diǎn)。沉淀反應(yīng)發(fā)展緩慢，有時(shí)需要好幾天才能得出結(jié)果。單*個(gè)測(cè)定，能被分析的未知的東西很有限，且此技術(shù)相對(duì)來(lái)說(shuō)靈敏度不是很高。進(jìn)行RID時(shí)，先在玻璃板上鋪一薄層瓊脂，整個(gè)瓊脂內(nèi)均勻地含有溶解的抗體試劑。在瓊脂*打一小孔，孔里放置（標(biāo)準(zhǔn)或未知的）抗原，接著抗原在瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，形成一個(gè)濃度梯度?？乖诃傊瑑?nèi)移動(dòng)時(shí)，被抗體結(jié)合，但在孔附近的抗原過(guò)量帶，抗原-抗體復(fù)合物仍保持可溶?？乖涂乖?抗體復(fù)合物繼續(xù)擴(kuò)散，直到等價(jià)帶中有足夠的抗體被結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物晶格。等價(jià)帶中形成的沉淀在含抗原的孔周?chē)纬森h(huán)狀。標(biāo)本中抗原濃度越高，等價(jià)帶中需要的抗體越多，沉淀環(huán)的直徑越大。沉淀環(huán)的平方（即面積）與抗原的濃度成正比。

典型的RID測(cè)定是：把抗體加入到融化的瓊脂中，然后把瓊脂倒在一玻璃載玻片上，讓它凝固。在凝膠中打孔，各孔中分別加入未知標(biāo)本和一系列已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)物。將載玻片置于濕的溫箱中孵育30分鐘到2小時(shí)，然后就可以測(cè)定沉淀環(huán)的直徑。RID不需要特殊儀器，臨床上許多小的實(shí)驗(yàn)室都使用該技術(shù)。

也可用比濁法來(lái)對(duì)沉淀反應(yīng)進(jìn)行定量。比濁法比凝膠技術(shù)更敏感、更快速，且能自動(dòng)化。如前邊所提到的，比濁法檢測(cè)的是被散射的光，散射光的強(qiáng)度與溶液形成的抗原-抗體復(fù)合物的分子量的平方成比例。在終點(diǎn)（平衡）比濁法中，抗原和抗體孵育30分鐘到2小時(shí)，測(cè)定散射光，將它和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比，該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上的散射光與抗原濃度相對(duì)應(yīng)。在速率比濁法中，抗原與抗體混合后，在很短的一段時(shí)間內(nèi)，立即檢測(cè)多個(gè)散射光，通過(guò)這樣，可以測(cè)定出抗原-抗體復(fù)合物形成的起始速率。散射光形成的速率越快，表明抗原抗體復(fù)合物形成的速率越快和抗原的濃度越高。比濁免疫分析法快速、可靠、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。利用商業(yè)提供的設(shè)備和抗體試劑，許多蛋白質(zhì)都可以在臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)。自動(dòng)化的比濁法也可用于血清Igs(包括IgE),白蛋白,C3,C4,轉(zhuǎn)鐵蛋白, α1抗*,C反應(yīng)蛋白,C1 酯酶抑制因子的定量檢測(cè);尿液中肌球蛋白和白蛋白水平的測(cè)定;以及脊柱液中IgG和白蛋白水平的檢測(cè)。
第二類(lèi)免疫測(cè)定需要用一種“通訊群體"對(duì)反應(yīng)物（抗原或抗體）中的一個(gè)進(jìn)行修飾。放射性核素，酶，熒光染料或發(fā)光的分子都可用做出現(xiàn)了抗體結(jié)合抗原的信號(hào)。這些方法在技術(shù)上實(shí)施起來(lái)更困難，但它們都是必要的，因?yàn)樯飿?biāo)本中微量（ng/ml）抗原或抗體的檢測(cè)和定量都要求更高的靈敏度。zui先描述RIA的原理是1960年胰島素的測(cè)定，而且這門(mén)技術(shù)是靈敏度zui高的技術(shù)之一。11 典型的競(jìng)爭(zhēng)性替代RIA中：先放射性標(biāo)記抗原，然后將標(biāo)記抗原與抗體一起孵育，再把與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原與未結(jié)合的抗原分離，zui后檢測(cè)已結(jié)合的放射性活度。如果在加入標(biāo)記抗原的同時(shí)也加未標(biāo)記的抗原，未標(biāo)記抗原就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，與被提供的抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原就變少。試管里含固定量的標(biāo)記抗原和抗體，如果往里加入遞增濃度的未標(biāo)記抗原，就可構(gòu)建一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。這種方法叫競(jìng)爭(zhēng)替代法因?yàn)?a data-cke-saved-href="http://www.kytsldc.cn/st154696/list_643464.html" href="http://www.kytsldc.cn/st154696/list_643464.html">抗體試劑的量不足以結(jié)合所有標(biāo)記和未標(biāo)記的抗原分子。做這個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，臨床醫(yī)生一定要有特異性的抗血清或單克隆抗體，純化的放射性標(biāo)記的抗原，純化的未標(biāo)記的抗原標(biāo)準(zhǔn)物，以及分離結(jié)合跟游離抗原的方法。多數(shù)RIAs都是用125I放射活性通訊群體，用γ閃爍記數(shù)儀檢測(cè)發(fā)出的放射性活度。由于具有敏銳的分析靈敏度，RIAs的用處很大，但由于放射性核素的使用，它們的放置時(shí)間又很短。zui常見(jiàn)的分離技術(shù)是使用第二抗體，該抗體能跟*抗體反應(yīng)形成沉淀。已結(jié)合的放射性標(biāo)記的抗原跟復(fù)合物一起沉淀下來(lái)，通過(guò)離心分離結(jié)合和游離的放射性活度。zui近，已設(shè)計(jì)出一些使用固相結(jié)合抗體的方法。這些方法中，抗體結(jié)合于固相表面，如試管內(nèi)壁或聚苯乙烯珠粒。往試管里加入標(biāo)準(zhǔn)或未知抗原以及放射性標(biāo)記抗原后，通過(guò)簡(jiǎn)單地傾倒試管或移走珠粒就可分離結(jié)合和游離抗原。

固相結(jié)合抗體的使用引致了“三文治"免疫測(cè)定的發(fā)展，也叫兩位點(diǎn)免疫測(cè)定方法（IMAs）。在這一類(lèi)型的方法中，臨床醫(yī)生純化和放射性標(biāo)記第二抗體而不是標(biāo)記純化的抗原。*抗體與固相結(jié)合，然后加入抗原，zui后通過(guò)加入放射性標(biāo)記的第二抗體，該抗體也能與抗原結(jié)合，就可以檢測(cè)與固相結(jié)合的抗原。隨著更高濃度的的抗原標(biāo)準(zhǔn)物的加入，更多的標(biāo)記抗體與固相結(jié)合，從而形成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。免疫放射測(cè)定（IRMA）技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記的是純化的抗體而不是純化的抗原?？贵w是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)分子，容易被放射性核素、酶和能發(fā)光的分子標(biāo)記上。但有些抗原在化學(xué)標(biāo)記過(guò)程中卻有可能被改變或遭到破壞。

如前所述，兩位點(diǎn)IMA的基本原理是可以使用多種通訊群體。也就是說(shuō)，除了使用放射性核素標(biāo)記的第二抗體，第二抗體還可與酶或發(fā)光分子結(jié)合，然后用分光光度計(jì)或發(fā)光計(jì)而不是用γ閃爍記數(shù)儀來(lái)定量檢測(cè)結(jié)合抗體。如果用的是酶標(biāo)記，該方法叫EIA。典型的EIA是通過(guò)加入底物溶液來(lái)定量檢測(cè)已結(jié)合的酶連第二抗體，該底物被酶水解后顏色發(fā)生改變。因此，加入到試管里的抗原越多，被結(jié)合的酶連二抗也越多，同時(shí)，在給定的時(shí)間內(nèi)，顏色強(qiáng)度的變化也越大。許多EIAs都用微量滴定板進(jìn)行，然后用自動(dòng)分光光度計(jì)定量，該分光光度計(jì)能直接讀取多孔板的吸光度。EIAs有好幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：不使用同位素，試劑有較長(zhǎng)的放置時(shí)間，沒(méi)有廢物處置問(wèn)題。三文治EIA方法的分析靈敏度與競(jìng)爭(zhēng)性替代RIA相近。