凝膠染色方法對(duì)蛋白質(zhì)分辨率的影響

提高雙向凝膠電泳的分辨率是蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚待解決的課題及技術(shù)發(fā)展方向，影響蛋白質(zhì)分辨率的因素較多，其中凝膠染色方法對(duì)蛋白質(zhì)分辨率的影響不可忽視，它影響了實(shí)驗(yàn)的顯像結(jié)果，直接干預(yù)了后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。ELISA試劑盒目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的是考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法兩種。

考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue，CBB G-250)的化學(xué)名稱為二甲花青亮藍(lán)，偏酸性，與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)結(jié)合，顏色由棕黃色轉(zhuǎn)為深蘭色。考馬斯亮藍(lán)染色法可以達(dá)到微克級(jí)檢測(cè)水平，著色程度與蛋白量的線性動(dòng)力學(xué)相關(guān)范圍廣，適合定量分析。該法由于較低的成本、使用方便及與下游的質(zhì)譜鑒定技術(shù)的良好相容性，而得到了非常廣泛的使用。然而微克級(jí)的檢測(cè)水平使它漏檢了相當(dāng)多的低豐度蛋白質(zhì)，日益成為蛋白質(zhì)組學(xué)的瓶頸，因此大量提高染色靈敏度的研究及各種染色液的配方和方法應(yīng)運(yùn)而生，經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道的方法眾多，評(píng)價(jià)不一。我們的試驗(yàn)選擇了3種常用的考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行比較，測(cè)得傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏度可達(dá)幾百納克，膠體考馬斯亮藍(lán)染色法能檢測(cè)到幾十納克蛋白，改良考馬斯亮藍(lán)染色法則可達(dá)幾納克蛋白水平。考馬斯亮藍(lán)染色法經(jīng)過改進(jìn)能獲得高的蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度，甚至可與銀染媲美。

銀染法是利用銀離子與氨基酸共價(jià)結(jié)合，還原劑的加入使與膠內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合的銀離子形成金屬銀而顯色。文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)限度可低于1 ng的蛋白質(zhì)，其靈敏度比傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法高約100倍，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但銀染步驟復(fù)雜，繁瑣，且著色線性動(dòng)力學(xué)的覆蓋范圍窄，導(dǎo)致蛋白質(zhì)差異顯示的不準(zhǔn)確性，同時(shí)由于游離銀離子及相關(guān)試劑的存在，給后續(xù)分析及鑒定帶來一定的實(shí)際困難。我們的實(shí)驗(yàn)只采用了一種銀染法，結(jié)果顯示銀染法的靈敏性高于所有考馬斯亮藍(lán)染色法，4 ng的蛋白質(zhì)條帶也能顯現(xiàn)，但蛋白質(zhì)鑒定成功率低。ELISA試劑盒

蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度的影響因素

蛋白質(zhì)著色顯示的靈敏性既取決于染色試劑，如上述分析，又與染色過程中涉及的有機(jī)溶劑及離子有關(guān)。在考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有機(jī)溶劑的使用。甲醇和乙醇在染色里起固定作用，把蛋白質(zhì)固定在凝膠中或阻滯它們?cè)谀z中擴(kuò)散。同時(shí)也去除電泳過程中的干擾染色過程的物質(zhì)，如去垢劑、還原劑和緩沖液等成分。乙酸的作用既是輔助固定蛋白質(zhì)同時(shí)又維持染液的酸性度，以利于考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合。他們的存在有利于獲得背景清晰、信噪比高的圖像。由于3種有機(jī)溶劑的相似作用，我們?cè)谀z體考馬斯亮藍(lán)染色法及改良考馬斯亮藍(lán)染色法里，保留乙醇作為*的固定清潔劑，用磷酸替代乙酸發(fā)揮酸化作用，結(jié)果顯示兩種考馬斯亮藍(lán)染色法獲得的圖像背景比傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法的要清晰，條帶也銳利。

在膠體考馬斯亮藍(lán)染色法中，酸性的乙醇介質(zhì)中加入硫酸銨，使得著色劑形成膠體染色顆粒，膠本身可不被顯著著色，蛋白染色靈敏度得以提高。而在改良考馬斯亮藍(lán)染色法中，在高酸、高離子環(huán)境下，蛋白質(zhì)的葡糖胺和天冬酰胺酸質(zhì)子化，更利于與染色劑發(fā)生結(jié)合。因此2種染色法呈現(xiàn)出背景清晰、蛋白檢測(cè)多的圖像，且在改良考馬斯亮藍(lán)染色法中由于高酸、高離子存在，靈敏度出現(xiàn)提高，幾接近銀染水平。

甲醛在銀染中發(fā)揮還原劑作用，使結(jié)合在蛋白質(zhì)上的銀還原而顯色。甲醛濃度影響銀染效果，濃度一般為400～500μl/L。甲醛濃度較高時(shí)膠顏色發(fā)黃，背景色混雜，難以發(fā)現(xiàn)目的點(diǎn);濃度較低不僅染色時(shí)間延長，而且不易著色。銀的絡(luò)合劑*防止自由銀離子還原為金屬銀，可減少非特異染色，降低背景染色，其濃度一般為0.1～0.2mg/L。該絡(luò)合劑用量過多，膠顏色過深;少則不足以螯合掉游離的銀離子，膠顏色發(fā)黑。ELISA試劑盒

質(zhì)譜兼容性的影響因素

考馬斯亮藍(lán)G-250在一定的pH時(shí)，這種染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物被*解聚。適應(yīng)于蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定;而銀染使用的銀離子及醛類造成肽間的相互交連，影響膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解及洗脫，降低了蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的氨基酸序列覆蓋率，考馬斯亮藍(lán)染蛋白質(zhì)鑒定的成功率在60%～80%之間，遠(yuǎn)高于銀染鑒定的成功率(30%～60%);而我們的結(jié)果是，前者的質(zhì)譜鑒定成功率為50%，后者僅為5%。鑒于此，我們也在不斷地尋找新的方法，以提高銀染鑒定的成功率。