免疫組化染色前處理技術(shù)操作規(guī)范

1、取材：理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都認(rèn)為組織在加熱抗原修復(fù)過程中造成脫片的主要原因是取材過厚或脫水浸蠟處理不當(dāng)所致。良好的取材、固定、脫水過程是免疫組化質(zhì)控的前提，如果H&E切片都做不出滿意的染色結(jié)果，那么免疫組化染色也將無從談起，根本無法保證染色質(zhì)量。

2、固定：在眾多的組織固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等），不同的實(shí)驗(yàn)方法在使用上各有千秋。但在保持組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、抗原可測定性、組織滲透性以及試劑的價(jià)格上，福爾馬林是、既經(jīng)濟(jì)又通用。而含酸或含汞的固定液對抗原保存均不理想。組織離體后固定一般不要超過30分鐘，在常溫條件下固定時(shí)間為8-24小時(shí)。同時(shí)還要注意避免福爾馬林過度固定造成的組織抗原丟失，有研究發(fā)現(xiàn)新鮮組織經(jīng)過福爾馬林一周固定后組織抗原丟失嚴(yán)重，抗原幾乎不能被檢測，因?yàn)榻M織固定后會(huì)引起蛋白或蛋白分子之間形成交聯(lián)，導(dǎo)致抗原位點(diǎn)遮蓋，可以通過抗原修復(fù)方法來修正，若加抗體前不采用抗原修復(fù)，則免疫組化染色常不能到達(dá)理想結(jié)果或不成功。組織同樣不能長時(shí)間放置在70%的乙醇中，酒精固定后的組織形態(tài)不如福爾馬林固定的組織。脫鈣液對抗原破壞較為嚴(yán)重，因此在組織脫鈣前在福爾馬林液中固定48小時(shí)，若組織沒有固定透則酸會(huì)破壞抗原，脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時(shí)間都必須盡量控制在zui低的限度。

3、浸蠟：我們認(rèn)為浸蠟溫度應(yīng)控制在58~60℃左右，浸蠟用的石蠟應(yīng)經(jīng)常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆，細(xì)胞收縮，更容易掉片。

4、切片厚度：用于免疫組織化學(xué)染色的切片厚度為3-4微米。為防止在染色過程中脫片，需要使用硅化玻片裱片。

5、硅化玻片的制備：載玻片經(jīng)酸洗沖洗干凈后烤干； 2%APES丙酮或*中浸泡1~2min；丙酮或*洗1~2分鐘；蒸餾水浸洗1~2min；烤干備用。

6、烤片：切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分鐘左右。有些實(shí)驗(yàn)室采用烤片過夜。有報(bào)導(dǎo)烤片溫度超過60℃時(shí)，烤片時(shí)間超過18小時(shí)的切片，免疫組化染色強(qiáng)度比烤4小時(shí)的切片要略弱。溫度過高或時(shí)間過長均會(huì)影響抗原的活性，原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。

7、切片保存：一些實(shí)驗(yàn)室研究人員習(xí)慣將組織蠟塊連續(xù)切片后長期保存在室溫條件下，切片后的組織在室溫下長期保存抗原可以損失。邁新實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蠟塊切片后，在室溫下保存三個(gè)月以上，免疫組化染色結(jié)果會(huì)出現(xiàn)減弱或陰性情況。并進(jìn)行了新、舊切片的保存時(shí)間對照實(shí)驗(yàn)，選擇11種不同組織蠟塊每例連續(xù)切片10片，共110片，常溫空氣中放置一個(gè)月、三個(gè)月、半年、一年與新切片進(jìn)行成對對照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：組織蠟塊切片后在室溫下保存三個(gè)月，抗原對多數(shù)抗體的敏感性約下降一半，部分切片丟失更多。切片保存半年多數(shù)的抗體不能出現(xiàn)陽性標(biāo)記結(jié)果，保存一年以上僅有個(gè)別的切片能夠有微弱的陽性表達(dá)，尤其核表達(dá)的抗原丟失更為突出。國外也有類似的資料報(bào)道。其原因可能與空氣中的氧化作用有關(guān)，所以在實(shí)際工作可以采用蠟封切片來避免抗原損失以便長期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中實(shí)驗(yàn)的切片更應(yīng)注意切片的保存。

8、脫蠟：免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同，免疫組化實(shí)驗(yàn)室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離，以保證脫蠟*，否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。