實(shí)驗步驟

1. 蛋白質(zhì)雙向電泳

1) *向固相pH梯度等電聚焦電泳

a. 上樣：*向等電聚焦采用膠內(nèi)加樣的方法進(jìn)行。吸取一定量的蛋白樣品(銀染樣品的蛋白上樣量為140 ug計，考染樣品為1.3 mg)加入重泡漲液(8 mol/L尿素，2%CHAPS，痕量濱酚藍(lán)，20 mmol/L DTT，0.5 % IPG buffer)，使終體積達(dá)到350ul。混勻后均勻加在IPG膠條holder的正、負(fù)極之間。將預(yù)制IPG膠條(pH 3 -10 NL)除去保護(hù)膜，膠面向下，覆于holder中的樣品之上；慢慢下壓膠條，并前后移動，避免生成氣泡。在膠條上方均勻封以1 ml覆蓋油，蓋上蓋子。

b. 等電聚焦：將裝有樣品和IPG膠條的strip holder置一向電泳儀(IPGphorTM Isoelectric Focusing System)上進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦參數(shù)：0V電壓下泡漲3h，30V電壓下泡漲10 h，500 V電壓下電泳0.5 h，2000V電壓下電泳0.5 h，5000 V電壓下電泳0.5 h，8000 V電壓下電壓20 h。

c. 膠條的平衡：*向電泳結(jié)束后，取出IPG膠條平衡兩次，每次15 min。平衡緩沖液(50 mol/L Tris buffer pH 8.8，6 mol/L尿素，30甘油，0.8 g澳酚藍(lán)，20 mmol/L DTT，含2 % (w/v) SDS)可減少電內(nèi)滲，有利于蛋白質(zhì)從*向轉(zhuǎn)移到第二向。在第二步平衡中用100mmol/L碘乙酞胺代替DTT以除去*步平衡時的DTT。平衡后的IPG膠條沿邊緣用濾紙吸去多余的平衡液。

2) 第二向垂直SDS-PAGE

     根據(jù)IPG conversion Kit的體積，配制大小為200 mmX200 mmX 1mm，濃度為12.5%T，3.3%C的均勻膠。將平衡好的IPG膠條移至凝膠上方，用0.5%瓊脂糖電泳緩沖液封閉。電泳的緩沖液系統(tǒng)為Tris-Glycine-SDS系統(tǒng)(500 ml，SX，7.5 g Tris，2.5 g SDS，36 g Glycine)。一向膠條和二向膠接觸面避免氣泡產(chǎn)生；封膠溫度不能過高，封膠時不要引入氣泡。

    電泳參數(shù)設(shè)置：14-15℃恒溫下，以每膠條計

    20 mA恒流電泳40 min

    30 mA恒流電泳至澳酚藍(lán)電泳到底部。

2. 染色

1) 銀染法：將二向電泳完成后的SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至固定液(40%無水乙醇，10%冰醋酸)中，固定30 min；棄固定液換敏化液(30%無水乙醇，6.8%醋酸鈉，0.2%*，0.5%戊二醛)敏化30 min；棄敏化液，以雙蒸水200 ml洗2次，每次30 min；之后置于銀染液((0.25%*，40%甲醛)染色20 min，染色時避光；棄銀染液，以雙蒸水200ml洗2次，每次1 min；顯色液((2.5%碳酸鈉，20%甲醛)顯色2-5 min，至蛋白質(zhì)點(diǎn)*顯現(xiàn)為止；棄顯色劑，立即換終止液(1.46 %EDTA)，終止顯色10 min；以超純水洗3次，每次5 min。

2) 考馬斯亮藍(lán)染色(考染)法：將二向電泳完成后的SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至固定液(50%無水乙醇，10%冰醋酸的水溶液)中，固定30 min以上；棄固定液，加入染色液(10%冰醋酸，G-350過濾所得)，熱染10 min；之后轉(zhuǎn)移至脫色液中(10%冰醋酸水溶液)過夜，直至背景色脫盡；超純水清洗。