星形膠質(zhì)的培養(yǎng)

    星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著多種作用，組成血腦脊液屏障，營養(yǎng)和支持神經(jīng)元，與神經(jīng)元突觸的發(fā)生有著密切。

1．材料

(1)材料來源：新生1周內(nèi)大鼠的腦組織。

(2)手術(shù)器械：解剖剪、解剖鑷、眼科剪和*。

(3)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿：用O．01％PLL涂布底壁，備用。

(4)清洗液：HBSS。

(5)消化液：O．05％*。

(6)培養(yǎng)液：DMEM和F12(1：1，V／V)混合培養(yǎng)液，添加15％FBS、6g／L葡萄糖、10萬I U／L*和100mg／L，*。

2．方法

(1)取材：在無菌條件下，通過頸動脈放血處死動物，分離出大鼠大腦皮質(zhì)。用預(yù)冷的HBSS沖洗3次后，在解剖顯微鏡下*剔除腦膜和表面血管。將皮質(zhì)剪成1mm3左右的小塊。

(2)消化：剪碎后加入O．05％*，將組織塊放37℃水浴中振蕩消化30min。然后，加入培養(yǎng)液，終止消化，用吸管輕輕吹打，離心(1000r／min，10min)。

(3)細(xì)胞懸液制備：吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液．然后用吸管輕輕吹打至組織塊消散。調(diào)整細(xì)胞濃度至O．5×106個／ml，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中．培養(yǎng)：30min。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出瓶中含未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用100目濾器過濾，將濾液離心(1000r／min，10min)。

(4)培養(yǎng)細(xì)胞：吸去上清液，用培養(yǎng)液懸浮沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。3d后換培養(yǎng)液，以后每隔2～3d換液1次。培養(yǎng)9～lOd。當(dāng)細(xì)胞分層生長時，將培養(yǎng)瓶放入恒溫水浴振蕩器內(nèi)，在37℃條件下螺旋水平振蕩15～18h。吸去懸液，剩余的貼壁細(xì)胞即為星形膠質(zhì)細(xì)胞。然后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3．結(jié)果觀察培養(yǎng)4h后，可見細(xì)胞長出細(xì)小突起。培養(yǎng)3～5d后，細(xì)胞數(shù)目增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例逐漸增大。9～10d后，細(xì)胞長滿瓶壁，細(xì)胞分層生長，星形膠質(zhì)細(xì)胞貼于底壁，少突膠質(zhì)細(xì)胞位于星形膠質(zhì)細(xì)胞層上面。經(jīng)振蕩純化后，少突膠質(zhì)細(xì)胞脫落，得到貼壁的星形膠質(zhì)細(xì)胞。可用抗膠質(zhì)原纖維性蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。

4．注意事項應(yīng)注意振蕩時間，以保證星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離。