DNA聚合酶及其應(yīng)用

（一）大腸桿菌DNA聚合酶I

是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細(xì)胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：ELISA試劑盒

5′→ 3′聚合酶活性（模板， 帶3′－OH游離基團(tuán)的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。

雙鏈特異性的5'→3'核酸外切酶活性。

3'→5'核酸外切酶活性。

從游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過對(duì)于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。

大腸桿菌DNA聚合酶I 的三種用途

1.利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的DNA探針

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。

2.用于DNA連接前的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。

3.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。ELISA試劑盒

（二）Klenow片段酶

Klenow片段是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，分子量為76KD 。

酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性

⑵3’ →5’ 的核酸外切酶活性

Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：

⑴修補(bǔ)限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端

⑵標(biāo)記DNA片段的末端

底物用［α－32P］－dNTPs

⑶cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成

⑷DNA序列的測(cè)定

（三）T4 DNA聚合酶

T4DNA聚合酶是從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，

1.酶催活性：

⑴5′→3′的聚合酶活性

⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶強(qiáng)100～1,000倍。

因此，可以綜合利用這兩種活性進(jìn)行取代合成反應(yīng)：

如果反應(yīng)體系中僅存在一種dNTP或沒有底物時(shí)，這時(shí)T4DNA聚合酶就會(huì)表現(xiàn)出3 ′→ 5 ′外切酶活力，從雙鏈DNA的3′開始降解，直到露出底物dNTP相同的堿基。然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。

2.T4DNA聚合酶的用途

(1)利用取代合成反應(yīng)制備探針

(2)標(biāo)記具有平末端的或具有3’－隱蔽末端的DNA片段

利用較強(qiáng)的3 ′→ 5 ′外切酶活性和 5′→3′聚合活性

(3)用于DNA序列分析

（四）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）

逆轉(zhuǎn)錄酶 是一種依賴RNA的DNA聚合酶。

此酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩個(gè)課題組的論文都發(fā)在了同一期的《Nature》雜志上。

zui普遍使用的是從鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（AMV）分離出來的。ELISA試劑盒

活性：一種可以有效地將mRNA反轉(zhuǎn)錄成DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(complementary DNA).

主要用途是 將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基因片段。