輔酶 I NAD(H)測定試劑盒NAD + 的提取

（分光光度法，50T/24 樣）

一、 測定意義：

輔酶 I NAD(H) 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞

中，NAD + 是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要

氫受體，生成的 NADH 經(jīng)電子傳遞鏈（又稱呼吸鏈，ETC）

傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時，形成大量的活性

氧（ROS），同時 NADH 再生為 NAD +。糖、脂、蛋白質(zhì)三

大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完

成。NAD(H)含量及 NADH/NAD +比值的高低可用于評價糖酵

解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD +比值說

明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外 NADH/NAD +

比值升高液可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外，NAD +降解產(chǎn)

物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作

用。

二、 測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD + 和 NADH，NADH

通過 PMS 的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲?

（Formazan），在 570nm 下檢測吸光值；而 NAD + 可被乙

醇脫氫酶還原為 NADH，進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測。

三、 需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機(jī)、移液器、1mL 比色皿、研

缽、冰和蒸餾水

五、 NAD + 和 NADH 提?。?/span>

1. 血清（漿）中 NAD + 和 NADH 的提取

NAD + 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體

積（mL）為1：5-10 的比例（建議取約0.1mL 血清（漿），

加入1mL 酸性提取液），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；

冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新

的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，

10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體

積（mL）為1：5-10 的比例（建議取約0.1mL 血清（漿），

加入1mL 堿性提取液），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；

冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新

的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，

10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2.

組織中 NAD + 和 NADH 的提取

NAD + 的提?。?/span>按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）

為1：5-10 的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL 酸性提取

液），冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰

浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新的

離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，

10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提?。?/span>按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）

為1：5-10 的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL 堿性提取

液），冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰

浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新的

離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，

10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3.

細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD + 和 NADH 的提取

NAD + 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按

照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4 個）：酸性提取液體積（mL）為

500-1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 酸

性提取液），超聲波破碎1min（冰浴，強(qiáng)度20％或200W，

超聲2s，停1s），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰

浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新的

離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，

10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提?。?/span>先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，

按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4 個）：堿性提取液體積（mL）為

500-1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 堿

性提取液），超聲波破碎1min（冰浴，強(qiáng)度20％或200W，

超聲2s，停1s），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰

浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一新的

離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，

10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

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