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南京信帆生物技術(shù)有限公司
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手把手教你做引物設(shè)計

時間:2015/11/23閱讀:2330
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南京信帆生物技術(shù)有限公司專業(yè)進(jìn)行PCR試驗,WESTERN BLOTTING,ELISA,免疫組化試驗待測,我們具有獨立的生物化學(xué)科研實驗室,承接各類試驗課題代做,歡迎廣大客戶前來咨詢。

要先對PCR目的序列的長度有個大致估計:

*步:找到Primer3的站點。你不用記住這個站點,但是要記住“Primer3”這個詞,然后打開GOOGLE首頁,輸入Primer3,跳出來的*個項目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”是http://frodo.wi.mit.edu/。

第二步:貼上模板序列。進(jìn)入Primer3站點,可以看到一個引物設(shè)計的界面。(附件Word文檔里有圖)在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進(jìn)去。注意是5'->3'方向的,數(shù)字或者空格都沒關(guān)系,軟件會自動過濾的。

第三步:重要參數(shù)設(shè)定

首先是“Product Size Ranges”,如果你不希望軟件給你隨便做的話,首先要調(diào)整的就是這個參數(shù)。默認(rèn)的參數(shù)實際上是從100到1000,這個你得自己改,如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期,盡可能把范圍改小,比如480-500,具體看情況調(diào)整。第二個參數(shù)是Primer Size”,默認(rèn)值一般可以用,但是,當(dāng)你用熟了這個軟件,你自己就知道該怎么改了。第三個參數(shù)是Primer Tm”這個和Primer Size差不多。

 

 

第四步:Pick primers 點一下這個按鈕,符合你大小預(yù)期的primer就 出來了,看看Primer3 Output的界面,多么漂亮!你要的primer出來了,而且有primer在序列上的位置比對圖,還要primer本身的信息,包括位置,長 度,Tm,GC含量,任何位置互補堿基數(shù),3'端互補堿基數(shù),以及引物序列,(注意,下游引物是5'->3'),還要產(chǎn)物大小,兩引物間任意互補堿 基數(shù),兩引物間3'端互補堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設(shè)定的范圍內(nèi),但還不是,將會給出警告。

 

 

第五步:引物設(shè)計檢驗:可 以僅僅設(shè)計一向引物,只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一個就可以。也可以自己定義引物,放在 Primer框里,(注意,下游引物的書寫反向仍然是5'->3')如果符合設(shè)定的條件,軟件將對給出引物評分,同時給出警告信息,根據(jù)警告信息可 以適當(dāng)對自定義引物做些調(diào)整即可,警告信息也讓你做實驗的時候心中有數(shù)。對于文獻(xiàn)發(fā)表的引物,都要檢查一下,這樣就可以避免被別人有意無意誤導(dǎo)。至于 RT-PCR所用的引物,是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子,這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。實際做引物的時候,要把內(nèi)含子都去掉,僅僅把外顯子序列放 入源序列框中,并且通過自定義引物設(shè)計的方法,使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內(nèi)含子和外顯子以及電子PCR,我將抽空 另做說明。

至于設(shè)計出來的引物的實際效果,根據(jù)我的經(jīng)驗,一般情況下都能做到PCR一次成功,也許隨便那一段序列做引物也能達(dá)到很好的效果,但是不管怎么說,軟件做引物可以讓自己心中有數(shù)。zui后,GOOD LUCK TO EVERYONE.

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