ELISA試劑盒-齊一生物

日前，中科院生物物理所劉光慧課題組、北京大學湯富酬課題組和中科院動物所曲靜課題組聯(lián)合開展的研究進一步拓展了基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍。研究人員利用基因編輯改寫了人類基因組遺傳密碼中的單個堿基，在實驗室中獲得了遺傳增強的“超級”干細胞（GES 細胞）。這種 GES 細胞能夠?qū)毎ダ虾椭铝鲂赞D(zhuǎn)化產(chǎn)生雙重抵抗作用，因此為開展安全有效的干細胞治療提供了可能的解決途徑。該研究工作于 7 月 7 日以“Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recoding”為題發(fā)表于學術(shù)雜志 Cell Research。

再生醫(yī)學領(lǐng)域存在兩個亟待解決的重要科學問題：*，干細胞治療的有效性，即如何獲得更多高質(zhì)量的可供移植治療的人類干細胞，如何賦予這些細胞移植物更強的自我更新、存活、定向分化以及對移植環(huán)境（如衰老與應(yīng)激）的耐受能力，以便令其在體內(nèi)發(fā)揮更為持久的治療效果；第二，干細胞治療的安全性，即如何有效降低細胞移植物在體內(nèi)形成腫瘤的風險。發(fā)表的這項研究工作聚焦于上述兩個重要問題，期望通過基因編輯手段對細胞內(nèi)的關(guān)鍵基因和信號通路進行調(diào)控，從而同時實現(xiàn)干細胞活力的提高及致瘤性的減弱，zui終獲得安全的人類干細胞移植物。

研究人員通過篩選可以延緩干細胞衰老的小分子化合物，發(fā)現(xiàn)抗氧化轉(zhuǎn)錄因子 NRF2 的激動劑能延緩人類早衰癥患者間充質(zhì)干細胞的加速衰老。在既往的低等模式生物研究中，NRF2 的缺失會導(dǎo)致生物體壽命縮短，反之其過表達則有助于壽命的延長。而生物物理所研究團隊 2016 年發(fā)表在 Cell 上的文章和此項研究則進一步揭示人類間充質(zhì)干細胞的衰老伴隨著 NRF2 蛋白水平的顯著下調(diào)；反過來，NRF2 的功能增強又能夠改善衰老間充質(zhì)干細胞的活力。因此，研究人員推測在編碼基因水平增強 NRF2 的活性或許能夠延緩人類干細胞的衰老。

為了證明這一點，研究人員利用第三代腺病毒載體 HDAdV 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)在人類胚胎干細胞中置換了 NRF2 基因第 2 號外顯子中的單一核苷酸（A245G）。這一單堿基置換使得細胞中的 NRF2 蛋白脫離了其抑制蛋白 KEAP1 的束縛，進而通過轉(zhuǎn)位至細胞核，激活一系列抗氧化和細胞保護基因的表達。

隨后，研究人員將基因編輯的人類胚胎干細胞定向分化成為具有治療潛力的間充質(zhì)干細胞，并發(fā)現(xiàn)這些間充質(zhì)干細胞的自我更新以及抵抗應(yīng)激和細胞衰老等能力均獲得了顯著增強。此外，由該種胚胎干細胞定向誘導(dǎo)分化而來的血管內(nèi)皮細胞也表現(xiàn)出強大的抵御氧化損傷的能力。這些結(jié)果均說明該遺傳增強策略能夠賦予人類干細胞及其分化衍生物更強的活性和自我保護能力。

與此同時，研究人員還考察了 GES 細胞在經(jīng)過體內(nèi)移植之后是否也會具有更強的存活、整合和組織修復(fù)能力。研究結(jié)果表明，將上述 GES 細胞移植入小鼠體內(nèi)后能夠表現(xiàn)出更強的存活和整合能力，并能夠顯著促進缺血損傷模型小鼠后肢血流的恢復(fù)，證明 GES 細胞在移植后能夠表現(xiàn)出優(yōu)于普通干細胞的再生修復(fù)能力。

圖 1. 遺傳增強型人類間充質(zhì)干細胞抵抗細胞衰老，在連續(xù)傳代后仍可保持較低的衰老相關(guān) b - 半乳糖苷酶活性及較長的端粒（上）；一系列 NRF2 下游抗氧化和細胞保護基因的表達在遺傳增強型間充質(zhì)干細胞中協(xié)同上調(diào)（中）；遺傳增強型間充質(zhì)干細胞具有對小鼠后肢缺血損傷更好的治療作用（下）

研究人員也同時開展了針對遺傳增強策略的安全性評價，發(fā)現(xiàn)盡管 GES 細胞具有更強的自我更新能力和體外傳代壽命，但是在移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后并不會形成腫瘤。令人興奮的是，GES 細胞還表現(xiàn)出對癌基因誘導(dǎo)的細胞惡性轉(zhuǎn)化的強抵抗作用。在諸多癌基因激活的情況下，GES 細胞仍然保持著高度的基因組穩(wěn)定性，移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后不會形成腫瘤。更有趣的是，經(jīng)過遺傳增強的人類胚胎干細胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)僅能產(chǎn)生比對照胚胎干細胞小得多的畸胎瘤。該實驗提示，即便 GES 細胞移植物中殘留了少量未分化的多能干細胞，其在體內(nèi)形成畸胎瘤的能力也已被大大削弱，這就進一步降低了利用遺傳增強型干細胞進行細胞移植治療的安全風險。

圖 2. 遺傳增強型人類間充質(zhì)干細胞對癌基因誘導(dǎo)的細胞惡性轉(zhuǎn)化具有強抵抗作用（左）；遺傳增強型人胚胎干細胞僅能形成相對較小的畸胎瘤（右）

綜上所述，該研究利用基因編輯技術(shù)實現(xiàn)了人類干細胞的遺傳增強，并從概念上證明了利用該策略獲得安全細胞移植物的可行性。通過 NRF2 基因的單堿基置換可以賦予人類干細胞更強的抵御應(yīng)激和衰老的能力，以及在體內(nèi)更好的留存和再生修復(fù)功能，甚至對干細胞癌變的抵抗活性。該研究的意義不僅在于創(chuàng)造了一種安全的人類間充質(zhì)干細胞，更重要的是為針對不同組織類型及疾病特性設(shè)計不同遺傳增強方案的研究奠定了基礎(chǔ)，使得規(guī)模和標準化制備安全的人類細胞移植材料成為可能。