elisa檢測(cè)系統(tǒng)可謂是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中zui為靈敏的技術(shù)手段。可是在新老手操作過(guò)程中總是會(huì)出現(xiàn)或大或小的問(wèn)題，剛開(kāi)始做ELISA時(shí)就面臨很多困難，雖然有師兄鋪路，但還是常常做得一塌糊涂，比如說(shuō)花板，假陽(yáng)性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低。。。。。。自己也為此苦惱過(guò)很長(zhǎng)一段時(shí)間，隨著自己技術(shù)水平得提高，或多或少地也掌握了ELISA體系的脾氣，也是熟能生巧吧，現(xiàn)在做方陣，做ELISA已是輕車熟路了，以前檢測(cè)一種抗體用整整一下午還算得暈暈的，現(xiàn)在給我十個(gè)八個(gè)的從包被到顯色，一個(gè)工作日基本搞定。下面就由我拋磚引玉地來(lái)說(shuō)一下，做ELISA的經(jīng)驗(yàn)總結(jié):
1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識(shí)別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時(shí)，師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個(gè)道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對(duì)于*和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對(duì)其改造再加以包被，我把方法簡(jiǎn)要的列出如下:①親和素*:先親和素先包被載體，加入*化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。②脂類物質(zhì):可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。
2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于試驗(yàn)的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來(lái)包。應(yīng)注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗(yàn)還要有堅(jiān)固的理論外也要實(shí)踐，看一下zui終可不可以應(yīng)用到自己試驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、封閉：繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。但zui終選用什么，要依據(jù)試驗(yàn)具體來(lái)實(shí)踐。
4、洗滌板：可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)。因?yàn)榫郾揭蚁┑人芰蠈?duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)，在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。所以在洗板時(shí)會(huì)有一定誤差，人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)除外)，洗的不*或串了孔，對(duì)如此靈敏的ELISA系統(tǒng)可是不小的影響。
5、加抗體標(biāo)本(和二抗):注意該換槍頭時(shí)換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用PBS稀釋，也可用封閉液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費(fèi)，太低則著色淺。
6、顯色:顯色系統(tǒng)又很多，我們一開(kāi)始做的時(shí)候，要選擇適宜的顯色系統(tǒng)。注意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。
7、每次做盡量要把陰陽(yáng)空三個(gè)對(duì)照做好，如出現(xiàn)問(wèn)題也好分析。
相關(guān)知識(shí)：
1、問(wèn)：做間接Elisa法測(cè)試小鼠血清中的IgE抗體，設(shè)空白對(duì)照、和陰性對(duì)照、陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)為5千、1萬(wàn)、10萬(wàn)、20萬(wàn)不等，用的是*標(biāo)記的羊抗鼠IgE抗體，和親和素的辣根過(guò)氧化物酶?？墒墙Y(jié)果除了空白對(duì)照孔沒(méi)有顏色外，其余各孔全有顏色，而且OD值都相差不大，為什么?
回答：可能原因如下：
(1) 水質(zhì)被金屬離子等污染;防止辦法盡量使用新鮮水或蒸餾水。
(2) 洗滌不充分，樣品中其它成分殘留或酶殘留;防止辦法洗滌液應(yīng)注滿微孔，充分洗滌。
(3) 移液頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不*; 防止辦法移液頭一次性使用。
(4) 酶標(biāo)板靈敏度過(guò)高。
(5) 一抗顯色時(shí)間的控制等等，關(guān)于ELISA的每一步都要注意才行。
2、ELISA加樣時(shí)的防錯(cuò)小經(jīng)驗(yàn)
(1)用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報(bào)紙，墊在下面，這樣，加過(guò)標(biāo)本的小孔看過(guò)去下面的字會(huì)變小，沒(méi)加的字正常，非常容易區(qū)分。
(2)可以利用液面反光與沒(méi)有加的孔加以區(qū)別
(3)在標(biāo)本加完后，再把加樣槍全壓下，使液面產(chǎn)生小氣泡，也可以加以區(qū)分
3、棋盤試驗(yàn)的操作方法:
(1)將抗原按一定的梯度倍比稀釋后，按照ELISA從上到下(或者從左到右)的順序包被。
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