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夾心法ELISA檢測可溶性白介素2受體實(shí)驗(yàn)方法

閱讀:551發(fā)布時(shí)間:2018-8-3

  可溶性白細(xì)胞介素2受體SIL-2R存在于人的血清、尿液及腦脊液中,其濃度的高低與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療效果及預(yù)后有密切關(guān)系,如成人T淋巴細(xì)胞白血病(ATL)艾滋病(AIDS)、B細(xì)胞慢淋、毛細(xì)胞白血病,以及腎移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)或異基因骨髓移植發(fā)生移植物抗宿主時(shí),患者血清中SIL-2R水平明顯升高。SIL-2R的檢測多采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù),其中夾心法ELISA是一種較簡單的檢測方法,國外已廣泛應(yīng)用于臨床及基礎(chǔ)免疫學(xué)研究。
㈠ 基本原理:
將抗Tac特異性單克隆抗體Ab1吸附于固相載體,識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清等標(biāo)本中Tac并與之結(jié)合。應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的識(shí)別另一種Tac表位的特異性單克隆抗體Ab2識(shí)別固定于固相載體的Tac并與之結(jié)合。通過酶催化底物顯色反映待檢標(biāo)本中游離Tac的水平。
㈡ 操作步驟:
1. 刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC):取外周血10ml,肝素抗凝,常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞,加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,2×106/孔,RPMI1640-10%FCS+PHA(3μg/ml,Wellcome公司,37℃、5%CO2培養(yǎng)72小時(shí),收集上清,-20℃保存待測。同時(shí)設(shè)未加PHA對(duì)照組。犚2可選用病人血清為待測標(biāo)本。
2. Ab1包被:用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗Tac特異性單克隆抗體(Ab1)犗!釋至5μg/ml,加至elisa板,100μl/孔,4℃包被72小時(shí)。
3. 封閉:1%BSA-PBS封閉,350μl/孔,37℃孵育2小時(shí)。
4. 加樣:ELISA板用PBS-T洗液洗3次,牻+PHA刺激單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清及對(duì)照組上清或病人血清倍比稀釋至1∶1024,每一稀釋度取100μl加至ELISA板。犙!HUT-102B2細(xì)胞培養(yǎng)上清為陽性對(duì)照,RPMI1640-10%FCS培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。37℃,孵育2小時(shí),洗滌。
5. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記另一種抗 Tac 特異性單克隆抗體Ab2以效價(jià)滴定的稀釋度稀釋)100μl。37℃孵育2小時(shí),洗滌。
6. 加底物顯色:各反應(yīng)孔加新鮮配制ABTS底物溶液100μl,37℃、孵育15分鐘。
7. 終止反應(yīng):各反應(yīng)孔加2%氟化鈉終止液50μl。
8. 結(jié)果判定:首先肉眼觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色,稀釋梯度是否均勻。陽性、犚u性結(jié)果是否明顯。然后于ELISA檢測儀上測各孔O.D值(410nm)。
㈢ 試劑器材:
1. 試劑:包被緩沖液、洗滌液、稀釋液、終止液配制同常規(guī)ELISA方法。Tac特異性單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的Tac特異性單克隆抗體,HUT-102B2細(xì)胞培養(yǎng)上清,PHA。
2. 器材:聚苯乙烯塑料板,ELISA檢測儀,37℃水浴箱,4℃冰箱,CO2孵箱??烧{(diào)加樣器。
㈣ 注意事項(xiàng):
1. 包被抗體活性要較高,否則影響本實(shí)驗(yàn)敏感性。
2. 經(jīng)篩選比較,封閉液以1%BSA-PBS為好。
3. 酶標(biāo)結(jié)合物應(yīng)用前應(yīng)進(jìn)行效價(jià)滴定,選擇工作濃度。
4. 底物應(yīng)選用靈敏度較高的供氫體如ABTS等。
5. 如有條件,酶標(biāo)McAb可由*-McAb和親和素-HRP系統(tǒng)代替,以增加實(shí)驗(yàn)的敏感性。

關(guān)鍵詞:ELISA受體白介素2sIL-2R單克隆抗體包被血清


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