適用
適用于檢測(cè)水樣中有機(jī)磷酸鹽和有機(jī)磷酸酯（硫代磷酸鹽[酯] 殺蟲劑、氨基甲酸酯(類) 殺蟲劑）。檢測(cè)其它樣品時(shí)需要我公司取得相關(guān)前處理的資料。
原理
這是一個(gè)定性的有機(jī)磷酸鹽和有機(jī)磷酸酯的檢測(cè)方法。對(duì)乙酰*酯酶的抑制劑進(jìn)行了修飾。乙酰*酯酶（ACh-E）水解acetylthiocholine (ATC)，然而ATC可以與5,5’-Dithio-bis(2-Nitrobenzoic Acid) [DTNB]反應(yīng)
生成黃色可以在405 nm下讀取吸光度值。如果樣品中還有有機(jī)磷酸鹽和有機(jī)磷酸酯，那么它們將抑制ACh-E的活性，影響顏色反應(yīng)的發(fā)生。有機(jī)磷酸鹽和有機(jī)磷酸酯檢測(cè)限與他們對(duì)酶活性的抑制能力有關(guān)。
如果能證實(shí)樣品中僅含有機(jī)磷酸鹽和有機(jī)磷酸酯，這個(gè)測(cè)定和合適的標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)用可以進(jìn)行定量檢測(cè)。
試劑盒組成
1 | 1塊酶標(biāo)板 8條 X 12孔 |
2 | 1瓶l (藍(lán)蓋t), 用于稀釋 thesubstate (ATC), 5 ml. |
3 | 1 瓶 (綠蓋), 用于稀釋 lyophilized ACh-E, 3 ml. |
4 | 1 黃色瓶 1 ml 陽性殺蟲劑對(duì)照 5 ppb Diazinon（二嗪農(nóng),地亞農(nóng),敵匹硫磷） 溶解于50% MEOH |
5 | 1 黃色瓶 (橙黃色熒光蓋), 1 ml of OXIDIZER（氧化劑） . |
6 | 檢測(cè)緩沖液和氧化劑稀釋液(橙黃色熒光蓋), 10 ml. |
7 | 1 瓶 (紅蓋), 3 ml.-NEUTRALIZER（中和劑） |
8 | 1 瓶 (綠蓋) ACh-E, lyophilized（低壓凍干） |
9 | 1 瓶 (綠蓋), SUBSTRATE（酶作用底物）, ATC, lyophilized（低壓凍干） |
10 | 1 瓶 (黃色熒光蓋), CHROMOGEN(DTNB) 色原體3 ml. |
11 | 1 瓶 (紫蓋),STOPPING SOLUTION（終止液）, 3 ml. |
12 | 1黃色瓶 1ml 陰性殺蟲劑對(duì)照溶解于50% MEOH. |
保存和穩(wěn)定性
儲(chǔ)存在 2-8°C. 在有效期內(nèi)都可以使用。試劑盒用完后的垃圾要按照當(dāng)?shù)卣恼叻ㄒ?guī)處理。
需要但不提供的試劑
25-1000 ul 的移液器和吸頭
405-450 nm 酶標(biāo)儀
用于氧化劑稀釋的試管和管形瓶
樣品信息
1.水樣：
- 把水樣溶于等體積 MEOH中（例如：1ml水樣+ 1mlMEOH）。除水樣外請(qǐng)我公司索取前處理方法。
- 來自廢水表面的不溶殘留物或濃縮后的干物質(zhì)也可以處理。
- 包含粗物質(zhì)的水樣需要過濾(e.g. 0.2 um Anotop™ 25 Plus, Whatman, Inc.)。色素物質(zhì)或涂料對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響，因此要用類似的物質(zhì)做一個(gè)陰性對(duì)照。
2.蔬菜/水果：
- 稱量10克攪碎樣品于一個(gè)50mL的離心管里，加入20mL分析純甲醇，渦旋混勻1min，室溫（22.5±2.5）°C下轉(zhuǎn)速4000rpm離心3min;
- 過濾轉(zhuǎn)移一定體積上清液到干凈燒杯里，取1mL過濾液于一試管里，加入1mL蒸餾水稀釋；
- 渦旋混勻1min，可得待檢樣品液；
注：（若樣品OD/陰性質(zhì)控OD x* ＞ 20%為陰性，MRL為10ppb）
3.酒樣：
- 取5mL酒樣于一離心管內(nèi)，加入0.2gNaCl,2mL正己烷，進(jìn)行渦旋振蕩3min進(jìn)行萃取，靜置5min，轉(zhuǎn)移上層液至另一裝有0.4g無水NaSO4的離心管里，再重復(fù)一遍以上萃取步驟，合并全部有機(jī)相。
- 4000rpm轉(zhuǎn)速離心5min，轉(zhuǎn)移上層正己烷至干凈的試管中氮吹吹干，用1mL50%甲醇復(fù)溶干燥物，
- 復(fù)溶液過0.2um有機(jī)相濾膜，可得待檢樣品液；
注：（若樣品OD/陰性質(zhì)控OD x* ＞ 20%為陰性，MRL為0.5ppb）
試劑準(zhǔn)備
在使用試劑盒時(shí)所有試劑都要回復(fù)到室溫。
1）ACh-E –加3ml ACh-E diluent（稀釋液）到凍干的 ACh-E 中，蓋緊蓋適當(dāng)?shù)恼鹗?，在檢測(cè)前至少要溶解5min。
2）Oxidizer（氧化劑）–根據(jù)所測(cè)樣品的數(shù)量配制氧化劑。稀釋氧化劑（1份氧化劑+ 9份氧化劑稀釋液）。適當(dāng)?shù)恼鹗帲看螜z測(cè)前配制必須是新鮮的。
3）Substrate (ATC) （酶作用底物）– 加3ml ATC 稀釋液到凍干的ATC 中，蓋緊蓋適當(dāng)?shù)恼鹗帯?/span>
注意事項(xiàng)
操作要規(guī)范，在加完每種試劑后要混合均勻。注意在震蕩時(shí)不要把微孔中的液體溢出去（震蕩時(shí)可以用手拿著微孔板在桌面上做圓周運(yùn)動(dòng)。在加液時(shí)避免吸頭和反應(yīng)液直接接觸要把液體直接加到微孔板的底部。
確保每個(gè)微孔中加的液體的量一致。避免試劑的交叉污染和攜帶污染，添加每個(gè)樣品都要用干凈的吸頭。加液時(shí)吸頭不要和微孔壁上的液體接觸。如果在戶外操作要避免陽光直射。不要使用過期試劑。避免皮膚和粘膜與試劑接觸。如果試劑與皮膚接觸請(qǐng)用大量的水沖洗。
局限性
這個(gè)Abraxis OP/Carbamate 檢測(cè)方法對(duì)不同的有機(jī)磷酸鹽和氨基甲酸酯(類)的檢測(cè)特異性不同。請(qǐng)參考后面的特異性表。如果需要可以通過其它傳統(tǒng)的方法如GC, HPLC,驗(yàn)證。
對(duì)照
陽性對(duì)照：濃度為5 ppb Diazinon（二嗪農(nóng),地亞農(nóng),敵匹硫磷）。在每次檢測(cè)時(shí)都要做。
檢測(cè)步驟
在做檢測(cè)之前要認(rèn)真閱讀試劑配制方法和注意事項(xiàng)
- 在檢測(cè)用的酶標(biāo)板中加入50ul檢測(cè)緩沖液（橙黃色熒光蓋）。
- 在的檢測(cè)孔中加入25ul 適當(dāng)?shù)膶?duì)照或樣品。震蕩酶標(biāo)板15秒
3、在每個(gè)微孔中加入25ul 稀釋的氧化劑（diluted Oxidizer），震蕩酶標(biāo)板15秒，室溫孵育5min。
4、在每個(gè)微孔中加入25ul Neutralize 中和劑（紅蓋），震蕩酶標(biāo)板15秒。
5、在每個(gè)微孔中加入25ul ACh-E（綠蓋），震蕩酶標(biāo)板15秒，室溫孵育15min。
6、在每個(gè)微孔中加入25ul Substrate-ATC（藍(lán)蓋），震蕩酶標(biāo)板15秒。
7、在每個(gè)微孔中加入25ul Chromogen – DTNB（黃色熒光蓋），震蕩酶標(biāo)板15秒，室溫孵育15min。
8、在每個(gè)微孔中加入25ul終止液，震蕩酶標(biāo)板15秒，在405nm 或450nm下讀數(shù)，要確保微孔中沒有氣泡。
結(jié)果分析
陰性對(duì)照和沒有檢測(cè)到有機(jī)磷酸鹽和氨基甲酸酯的樣品將呈現(xiàn)深黃色。含有有機(jī)磷酸鹽和氨基甲酸酯的樣品與陰性對(duì)照相比將呈現(xiàn)比較淺的顏色。20%的顏色抑制作用指示了有機(jī)磷酸鹽和氨基甲酸酯的檢測(cè)限或高于檢測(cè)限。
注意：如果陰性對(duì)照不能產(chǎn)生黃色說明這次檢測(cè)無效需要重新檢測(cè)。
敏感性
精密度
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