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NK細(xì)胞活性檢測方法

時(shí)間:2016/1/4閱讀:2201
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    NK細(xì)胞是一種異質(zhì)性、多功能的細(xì)胞群,具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)功能,并參與移植排斥反應(yīng)和某些自身免疫性疾病的發(fā)生,因而通過制備NK細(xì)胞克隆對其功能進(jìn)行研究已受到人們的高度重視。測定人NK細(xì)胞活性多以K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞,而測小鼠NK細(xì)胞活性則用YAC細(xì)胞株,檢測方法多種多樣。

(一)形態(tài)法

    將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合溫育,繼而用臺盼藍(lán)或伊紅Y等活細(xì)胞拒染的染料處理,然后分別計(jì)數(shù)著染的死細(xì)胞和不著染的活細(xì)胞,推算NK細(xì)胞活性。

1.材料

(1)靶細(xì)胞:K562細(xì)胞株或YAC細(xì)胞株。

(2)效應(yīng)細(xì)胞:NK細(xì)胞。

(3)含15%NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液,5%臺盼藍(lán)染色液。

2.方法:

(1)效應(yīng)細(xì)胞的制備:將克隆的NK細(xì)胞用含15%NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮,計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至l×107/ml,備用。

(2)靶細(xì)胞的制備:取經(jīng)24h培養(yǎng)的靶細(xì)胞,用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌1次,1000r/min離心6min。棄上清液,用:RPMI 1640培養(yǎng)液重懸后計(jì)數(shù),并用0.5%臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),活細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上時(shí)可用作靶細(xì)胞。以RPMI l640培養(yǎng)液調(diào)整至1×105/ml,備用。

(3)效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞作用:用40孔培養(yǎng)板,對照組1~3孔,每孔加100μl靶細(xì)胞,再加入RPMI 1640培養(yǎng)液100μl;實(shí)驗(yàn)組4~6孔,每孔加100gl靶細(xì)胞,再加入效應(yīng)細(xì)胞100μl,效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為50:1?;靹颍?%CO2 37℃孵箱中培養(yǎng)過夜。

3.結(jié)果分析取m培養(yǎng)板,將細(xì)胞輕輕混勻成懸液,從每孔中取出30μl細(xì)胞懸液,加等量O.5%臺盼藍(lán)染液混合。室溫下5min后,計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)。對照組和實(shí)驗(yàn)組每孔各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,分別記錄死亡細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù),求出各組NK細(xì)胞活性的均值。

(二)酶釋放法

    將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合溫育,離心沉淀,取上清液檢測靶細(xì)胞遭破壞后釋放出的酶含量。

(三)熒光法

    用熒光素標(biāo)汜靶細(xì)胞,經(jīng)與效應(yīng)細(xì)胞共溫后,離心去上清液,用熒光計(jì)檢測剩余的活靶細(xì)胞的熒光。

(四)核素法

    將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合共溫后,離心檢測上清液或剩余靶細(xì)胞放射性的量,間接反映其活性。有靶細(xì)胞胞漿釋放法和胞核釋放法兩種。

(五)化學(xué)發(fā)光法

    當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸時(shí),效應(yīng)細(xì)胞呼吸暴發(fā),生成極不穩(wěn)定的O 2-及OH一,放出光子,在發(fā)光劑存在條件下,可被光電倍增管接受和計(jì)數(shù),發(fā)光量與NK細(xì)胞殺傷能力相關(guān)。

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