2 結(jié)果
2.1胎腦總RNA的提取及RT2PCR擴(kuò)增目的基因 28s、18s及5s3條帶明顯完整且無(wú)降解,A260nm/A280nm為1.79,RNA質(zhì)量
濃度為950mg/L。第1輪PCR產(chǎn)物在電泳圖中1000bp處有特異性條帶,與預(yù)期的957bp接近,為包含目的基因的大片段;第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行電泳時(shí),在750bp處有特異性條帶,與預(yù)期的763bp相近,為BDNF目的基因片段,見(jiàn)圖3A-B。
2.2 PTAT/HA2BDNF載體的構(gòu)建及酶切鑒定
重組質(zhì)粒PTAT/HA2BDNF經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示3.0kb和763bp2個(gè)片斷,3.0kb的片斷為PTAT/HA酶切后的大小,763bp為BDNF基因片斷大小,酶切證實(shí)構(gòu)建的表達(dá)載體PTAT/HA2BDNF是正確的,
2.3 DNA序列測(cè)定 經(jīng)測(cè)序證實(shí),重組表達(dá)載體pTAT/HA2BDNF經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后內(nèi)插入的堿基組成與GenBank（AF411339）中的人BDNF基因序列*一致。
3 討論
自從1989年德國(guó)科學(xué)家Leibrock等根據(jù)所測(cè)出的BDNF部分氨基酸殘基序列設(shè)計(jì)PCR引物,用RT2CR方法從豬腦mRNA中成功克隆BDNFcDNA以來(lái),BDNF基因的克隆和表達(dá)研究取得重大進(jìn)展。但是因?yàn)檠X屏障只允許分子量小于600Da的蛋白通過(guò),分子量約13KDa的BDNF不能穿透血腦屏障,這給BDNF用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的治療帶來(lái)困難。TAT白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的發(fā)現(xiàn)及其能穿透血腦屏障的特性,給藥物的應(yīng)用帶來(lái)希望。為此,本研究構(gòu)建pTAT/HA2BD2NF載體,以探討TAT攜帶BDNF穿透血腦屏障治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性。本研究選用的pTAT/HA載體為美國(guó)科學(xué)家Nagahara構(gòu)建的能夠產(chǎn)生高水平TAT融合蛋白的細(xì)菌表達(dá)子[12],pTAT/HA末端依次編碼6個(gè)*、TAT蛋白的11個(gè)氨基酸、血球凝集素標(biāo)記及多克隆位點(diǎn)。*標(biāo)簽有利于表達(dá)蛋白的純化及免疫學(xué)檢測(cè),血球凝集素標(biāo)記亦有利于免疫學(xué)檢測(cè),所以pTAT/HA是表達(dá)TAT融合蛋白較為理想的載體。本研究采用RT2PCR從胚胎腦組織中克隆BDNF,根據(jù)人BDNF的基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)外側(cè)引物,采用巢式PCR擴(kuò)增目的基因,從而降低擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性,提高反應(yīng)的特異性和靈敏度;將編碼BDNF的DNA序列克隆到表達(dá)載體PTAT/HA下游,便于直接表達(dá)融合蛋白TAT2BDNF。本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pTAT/HA2BDNF,重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定,測(cè)序結(jié)果表明克隆片段與報(bào)道序列同源性達(dá)100%,為下一步表達(dá)完整、功能性的融和蛋白TAT2BDNF,研究TAT穿透血腦屏障等打下了基礎(chǔ)。
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