來自廣島大學(xué)的專任講師Tetsushi Sakuma、Takashi Yamamoto教授，專任副教授Ken-Ichi T Suzuki及同事們在《Nature Protocols》雜志上，報告了一種利用基因組編輯技術(shù)的替代基因敲入方法的精簡實(shí)驗(yàn)方案。這一創(chuàng)新方法被稱作為PITCh系統(tǒng)（整合到靶染色體，Precise Integration into Target Chromosome）。
基因敲入是通過用一種基因替換另一種基因，以便在體內(nèi)測定它們是否具有相同的功能，或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到靶向基因治療目的的技術(shù)。基因敲入通常是通過共同導(dǎo)入可編程核酸酶和單鏈寡核苷酸或是包含左右同源臂的靶向載體，誘導(dǎo)同源重組（HR）依賴性的基因添加來實(shí)現(xiàn)。
盡管同源重組介導(dǎo)的基因敲入能夠插入大的DNA片段。構(gòu)建靶向載體往往很費(fèi)力，且在大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞和生物體中同源重組活性都相對較低。這一問題為同源重組介導(dǎo)的基因敲入技術(shù)應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域設(shè)置了技術(shù)障礙。
相比于當(dāng)前的方法，PITCh系統(tǒng)利用了TALENs 和CRISPR/Cas9技術(shù)借助微同源介導(dǎo)末端連接(MMEJ)，能夠更方便有效地將外源DNA插入到靶基因組位點(diǎn)中。這一新型的通用技術(shù)可幫助加快一些領(lǐng)域，如篩查候選新藥及構(gòu)建人類疾病細(xì)胞或動物模型的研究進(jìn)展。
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基因組編輯是一種在遺傳工程中使用的創(chuàng)新技術(shù)，使得研究人員能夠在特定的位點(diǎn)改造基因組。在這一技術(shù)中，研究人員利用了稱作為“分子剪刀”的工程核酸酶來在基因組的預(yù)期位點(diǎn)造成DNA斷裂。當(dāng)一些修復(fù)信號通路修復(fù)DNA斷裂時，可誘導(dǎo)包括將外源DNA插入到基因組中（基因敲入），和替代或移除靶基因組位點(diǎn)等遺傳修飾。
Sakuma說：“不同于當(dāng)前的一些采用TALEN或CRISPR-Cas9基因編輯工具的技術(shù)主要利用DNA斷裂修復(fù)信號通路——同源重組，PITCH系統(tǒng)是一種獨(dú)立于HR的替代基因敲入方法。由于可變的同源重組率，現(xiàn)有的基因敲入技術(shù)無法適用于所有細(xì)胞類型和生物。因此，我們瞄準(zhǔn)了另一條修復(fù)通路——MMEJ，開發(fā)出了這一PITCh系統(tǒng)。”
在這篇文章中，作者們描述了構(gòu)建理想載體，將它傳染到細(xì)胞中，選擇基因敲入細(xì)胞，及檢查敲入的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)過程及一個真實(shí)的成功例子。此外，還描述了一種在青蛙胚胎中實(shí)現(xiàn)基因敲入的簡單方法。這篇文章將允許研究人員很容易地使用這一強(qiáng)大的工具，并促成生命科學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用研究的進(jìn)展。
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