通常說來，底物的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于它們各自酶切反應(yīng)的Km值和酶的濃度，并且篩選應(yīng)該在基于koat/KIn值的基礎(chǔ)上進(jìn)行。然而，在同一次噬菌體展示中，合成肽段的是cat值、Km值及kcat/Km．值有很大范圍的不同。對多價底物噬菌體展示的反應(yīng)動力學(xué)研究表明，底物切割是一個單指數(shù)事件（singleexponential event），底物結(jié)合是其中的限速步驟。
由于底物噬菌體展示篩選技術(shù)的實驗本質(zhì)，在利用文庫篩選真正底物之前進(jìn)行一系列的預(yù)實驗是非常有必要和關(guān)鍵的。這樣的陽性對照實驗?zāi)軌蜃C明特異性的底物裂解能夠在相應(yīng)的文庫連接序列前后和選定的實驗條件下發(fā)生。在接下來的實驗中就可以選擇zui合適的酶的反應(yīng)濃度以及篩選過程中zui合適的反應(yīng)時間。需要注意的是，這些預(yù)實驗必須包括兩種底物噬菌體，一個帶有已知的能夠被切割的底物序列，一個帶有已知的非底物序列。使用相同數(shù)量的底物和非底物噬菌體分別與親和性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，之后加入要研究的蛋白酶進(jìn)行酶切。通過測定從每個樣本中釋放的噬菌體的滴度，就可以推測出每輪篩選中噬菌體可以富集到的程度。另一種優(yōu)化富集程序的方法是通過制備一系列不同的底物噬菌體門≥底物噬菌體的混合物[例如從1：103～106）]，從而模擬篩選過程。通過測定在每一輪篩選后得到的底物與非底物噬菌體的比值，我們可以預(yù)測到在某一固定底物濃度下的富集能力。
● 約lO12個菌落形成單位（cfu）的底物噬菌體陽性及陰性對照
● 濃度大于1012cfu/ml，約1012 cfu的文庫底物噬菌粒
● 約1012個噬菌斑形成單位（pfu）的輔助噬菌體，例如M13K07（New EnglandBiolabs），或者VCSMl3（Strata gene）
● 約long捕獲試劑（例如hGH結(jié)合蛋白、抗多肽抗體）
● 高親和力96孔板，如Nunc Maxisorp板（Nalge Nunc）
● 新鮮的（小于1周）F’大腸桿菌，如XL-Blue的劃線培養(yǎng)平板（Stratagene）
● 捕獲試劑的固定緩沖液（例如50mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9．6）
● 含0．05％Tween—20的磷酸鹽緩沖液（PBST）
● 適合要研究的蛋白酶的稀釋及反應(yīng)緩沖液
● 含2％脫脂牛奶的PBS
● 0．2mol/L*緩沖液，pH 2．0
● 1mol/LTris堿
● LB+100ug/ml氨芐*或LB+羧芐*的瓊脂平板或液體培養(yǎng)基
● 2XYT培養(yǎng)基
● 低蛋白或無蛋白結(jié)合的微孔板（例如NalgeNunc 96F型聚丙烯酰胺板）
