在液相色譜分析過程中，我們經(jīng)常遇到的問題主要有二種，一種與液相色譜儀器本身因素有關(guān)，如液相色譜的閥門、混合器、檢測(cè)器的光源以及其它的一些硬件設(shè)備。出現(xiàn)這類問題后，如果能找出問題根源，解決起來一般很簡(jiǎn)單，而且這類問題可以通過對(duì)儀器的精心維護(hù)來避免;而另一類問題則是分析方法本身造成的問題，如出現(xiàn)色譜峰形狀不好、峰與峰之間不能分開、基線飄移等等。不幸的是，如果出現(xiàn)這類問題，看起來似乎很明顯，但是要找出原因并解決這類問題卻非常困難。
為了減少出現(xiàn)這一類型的問題，就必須在分析之前，仔細(xì)研究并選擇一個(gè)好的分析方法，有了一個(gè)好的分析方法，就很容易獲得理想的分離效果，而且在出現(xiàn)問題是也很便于找出原因。要選擇一個(gè)好的分析方法，就必須對(duì)液相色譜分析的一些基本原則要有一個(gè)很深的了解。
一：分析方法選擇的基本原則
假如你想做一頓豐盛的晚餐，首先必須看一下食譜，然后檢查一下你所需的東西是否齊全，如果少了配料還必須去商店購買，這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，也必須按照一定的程序進(jìn)行，首先你必須要有專門的儀器和試劑，然后有目的地選擇分析方法，這樣你才可能得到好的分析結(jié)果，避免走一些彎路。
二：柱子的選擇
在液相色譜分析方法中zui重要的就是色譜柱的選擇，色譜分析人員面對(duì)幾百種色譜柱，你從何入手呢?
現(xiàn)在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱，其中以C18 和C8柱zui為流行。然而色譜分析并不是流行歌曲，這兩種色譜柱之所以運(yùn)用廣泛是因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子(如表一所示)，但 C18和C8經(jīng)常是的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別，但在我們實(shí)驗(yàn)室中以常使用的是C8柱。
色譜分析人員遇到的多數(shù)樣品需要利用反相色譜柱進(jìn)行分析，但一些樣品可能需要其它的分析技術(shù)才能成功地分離。
三：有機(jī)相的選擇
獲得成功分離的另一個(gè)重要因素就是流動(dòng)相有機(jī)溶劑的選擇，如果使用反相色譜柱可以有三種有機(jī)溶劑可以選擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其的優(yōu)點(diǎn)，但色譜分析人員很少能預(yù)見哪一種溶劑更合適，所以具體選擇哪一種溶劑你必須充分考慮同行的意見。
在我的實(shí)驗(yàn)室中多數(shù)工作分析藥物中的成份，其中有些樣品的紫外吸收很弱，所以分析時(shí)紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)為220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強(qiáng)，所以在波長(zhǎng)低于240nm時(shí)，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長(zhǎng)下也可使用，但是在低于220nm時(shí)，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空氣之間不發(fā)生作用，而四氫呋喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時(shí)須格外小心。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，在四氫呋喃中加入水可以解決這個(gè)問題(4)，但它與色譜柱平衡所需的時(shí)間比甲醇、乙腈長(zhǎng)，而且其不愉快的氣味也是一個(gè)不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的zui大優(yōu)點(diǎn)是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2ml/min之間。 考慮到理想溶劑的特點(diǎn)，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以的有機(jī)溶劑應(yīng)是乙腈，當(dāng)然利用甲醇作為有機(jī)溶劑的也較為常見。
四：水相的選擇
假如樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時(shí)普遍存在，而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動(dòng)相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個(gè)單位。在分析有機(jī)酸時(shí)，當(dāng)PH值低于3時(shí)，色譜柱一般還比較穩(wěn)定，然而當(dāng)PH值高于8時(shí)，就需要緩沖液，因?yàn)榇?/span>PH值已經(jīng)超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對(duì)高PH值物質(zhì)的分離，很少有這方面的報(bào)道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失。
考慮到樣品的特性及柱子的穩(wěn)定，建議在分析PH值較高的物質(zhì)時(shí)應(yīng)使用緩沖液，2.5mM的磷酸鹽緩沖液 (PH=2.5)是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選擇易揮發(fā)的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足PH值的控制要求。
五：其它的因素
在你選擇液相色譜的分析方法時(shí)，必須考慮到其它的一些因素，比如溫度。因?yàn)闇囟茸兓?/span>1度，保留時(shí)間將變化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性，這會(huì)使你更積極地投入到溫度選擇中去。在分析時(shí)柱溫一般比室溫高一點(diǎn)(如35℃)，因?yàn)榇藴匾卓刂?，而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度，從而降低柱壓。有時(shí)你需要利用其它的一些方法 ，如在流動(dòng)相中加入部分特殊的物質(zhì)，不過我建議在你實(shí)在必須時(shí)才用這種方法，記住KISS原則(Keep it simple ，stupid)，不要使你的流動(dòng)相過分復(fù)雜!
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