氣相色譜法
一 氣相色譜法概述
色譜法概述
色譜法是一種重要的分離分析方法，它是利用不同物質(zhì)在兩相中具有不同的分配系數(shù)（或吸附系數(shù)、滲透性），當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些 物質(zhì)在兩相中進(jìn)行多次反復(fù)分配而實(shí)現(xiàn)分離。在色譜技術(shù)中，流動(dòng)相為氣體的叫氣相色譜，流動(dòng)相為液體的叫液相色譜。固定相可以裝在柱內(nèi)，也可以做成薄層。前者叫柱色譜，后者叫薄層色譜。根據(jù)色譜法原理制成的儀器叫色譜儀，目前，主要有氣相色譜儀和液相色譜儀。
色譜法的創(chuàng)始人是的植物學(xué)家茨維特（Tswett）。1906年，他將從植物色素提取的石油醚提取液倒人一根裝有碳酸鈣吸附劑的豎直玻璃管中，然后用石油醚淋洗，結(jié)果使不同色素得到分離，在管內(nèi)顯示出不同的色帶，色譜一詞也由此得名。這就是zui初的色譜法。后來，這種方法逐漸廣泛地用于無色物質(zhì)的分離，但色譜一詞仍沿用至今，在50年代，色譜法有了很大的發(fā)展。1952年，詹姆斯和馬丁以氣體作為流動(dòng)相分析了脂肪酸同系物并提出了塔板理論。1956年范第姆特總結(jié)了前人的經(jīng)驗(yàn)，提出了反映載氣流速和柱效關(guān)系的范笨姆特方程，建立了初步的色譜理論。同年，高萊（Golay）發(fā)明了毛細(xì)管拄，以后又相繼發(fā)明了各種檢測(cè)器，使色譜技術(shù)更加完善。50年代末期，出現(xiàn)了氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的儀器，克服了氣相色譜不適于定性的缺點(diǎn)。近年代，由于檢測(cè)技術(shù)的提高和高壓泵的出現(xiàn)，液相色譜迅遠(yuǎn)發(fā)展，使得色譜法的應(yīng)用范圍大大擴(kuò)展。目前，由于能的色譜往、高靈敏的檢測(cè)器及微處理機(jī)的使用，使得色譜法已成為一種分析速度快、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣的分析儀器。
色譜法是一種分離分析技術(shù),經(jīng)色譜柱分離后,組分要借用其他檢測(cè)手段一一檢測(cè)，色譜法的本質(zhì)在于色譜柱高選擇性的分離作用和高靈敏度檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合?；旌辖M份的樣品在色譜柱中的分離依據(jù)是：
同一時(shí)刻進(jìn)入色譜柱的各組份，由于在流動(dòng)相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換的不同，隨流動(dòng)相在色譜柱中運(yùn)行時(shí)，在兩相之間進(jìn)行反復(fù)多次（103—106）的分配過程，使得原來分配系數(shù)具有微小差別的各組份，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進(jìn)而各組份在色譜柱中的移動(dòng)速度就不同，經(jīng)過一定長(zhǎng)度的色譜柱后，彼此分離開來，zui后按順序流出色譜柱而進(jìn)入檢測(cè)器，在色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或工作站上顯示出各組份的色譜行為和譜峰數(shù)值。基于上述原理建立的分析方法稱為色譜法。氣相色譜法是流動(dòng)相為氣體的一類色譜分析法。
二 氣相色譜方法開發(fā)
方法開發(fā)的一般步驟
就GC而言，就是首先確定樣品預(yù)處理方法，然后優(yōu)化分離條件。直到達(dá)到滿意的分離結(jié)果。zui后建立數(shù)據(jù)處理的方法，包括定性鑒定和定量測(cè)定。當(dāng)然這一方法要真正成為實(shí)用方法，還要進(jìn)行驗(yàn)證。下面是方法開發(fā)的一般步驟。
1） 樣品來源及其預(yù)處理方法
GC直接分析的樣品必須是氣體或液體，固體樣品在分析前應(yīng)當(dāng)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，而且要保證樣品中不含GC不能分析的組份（如無機(jī)鹽）或可能會(huì)損壞色譜柱的組份。
這樣，我們?cè)诮拥揭粋€(gè)未知樣品時(shí)，就必須了解它的來源，估計(jì)可能含有的組分，以及樣品的沸點(diǎn)范圍。如能確定直接進(jìn)樣分析，只要找一種合適的溶劑，如丙酮，己烷、氯仿，苯等就是GC常用的溶劑。一般講，溶劑應(yīng)具有較低沸點(diǎn)，從而使其容易與樣品分離。盡可能避免用水，二氯甲烷和甲醇作溶劑，它們對(duì)延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命不利。如果用毛細(xì)管分析，應(yīng)注意樣品濃度不要太高，以免造成柱超載，通常樣品的濃度為mg/ml級(jí)或更低。
如果樣品中有不能用GC直接分析的組分，或樣品濃度太低，就必須進(jìn)行必要的預(yù)處理，包括采用一些預(yù)分離手段，如各種萃取技術(shù)，濃縮方法，提純方法等。
2） 確定儀器配置
所謂儀器配置就是用于分析樣品的方法采用什么進(jìn)樣裝置，什么載氣，什么色譜柱及其什么檢測(cè)器。比如，要用GC分析啤酒的揮發(fā)性成分，就需要一個(gè)頂空進(jìn)樣器，要測(cè)定水中痕量含氯農(nóng)藥的殘留量，就要用電子俘獲檢測(cè)器。就色譜柱而言，常用的固定相有非極性的OV—1（SE—30）弱極性的SE—54，極性OV—17和PEG—20M等，可根據(jù)極性相似相容原理來選用，即分離一般脂肪烴類（如柴油或汽油）時(shí)多用OV—1（SE—30）。分析醇類和酯類（如含酒料）多用PEG—20M，分析農(nóng)藥殘留量則多用OV—17或OV—1701而要分析特殊的樣品，如手性異構(gòu)體，就需要特殊的色譜柱，對(duì)于很復(fù)雜的混合物，SE—54往往是首先的固定相。
3） 確定安初始操作條件
初始分離條件，主要包括進(jìn)樣量，進(jìn)樣器溫度，檢測(cè)器溫度，色譜柱溫度和載氣流速度。
1. 進(jìn)樣量要根據(jù)樣品濃度，色譜柱容量和檢測(cè)器靈敏度來確定。
2. 進(jìn)樣口溫度主要有樣品的沸點(diǎn)范圍決定，還要考慮色譜柱的使用溫度。首先要保證待測(cè)樣品全部汽化，其次要保證汽化的樣品組分能夠全部流出色譜柱，而不會(huì)在柱中冷凝。
原則上進(jìn)樣口溫度一般要接近樣品中沸點(diǎn)zui高的組分的沸點(diǎn)，但要低于易分解組分的分解溫度，常用條件為250℃—350℃。
實(shí)際操作中，只保證樣品*汽化即可而不必進(jìn)行很的優(yōu)化。
3. 色譜柱溫度的確定主要由樣品的復(fù)雜程度和汽化溫度決定。
原則上既要保證待測(cè)物的*分離，又要保證所有組分能流出色譜柱，且分析時(shí)間越短越好。組成簡(jiǎn)單的樣品用恒溫分析，這樣分析周期會(huì)短一些。對(duì)于組成復(fù)雜的樣品，常需要用程序開溫分離，因?yàn)樵诤銣貤l件下，如果柱溫較低，則低沸點(diǎn)組合分離得好，而高沸點(diǎn)組分的流出時(shí)間會(huì)太長(zhǎng)，造成峰展寬，甚至滯留在柱中造成柱污染，反之柱溫太高，低沸點(diǎn)組分又難以分離。
實(shí)際上，毛細(xì)柱的zui大優(yōu)點(diǎn)就是可以在較寬的溫度范圍內(nèi)操作。這樣既保證了待測(cè)組分的良好分離，又能實(shí)現(xiàn)盡可能短的分析時(shí)間。
一般地講，色譜柱的初始溫度應(yīng)接近樣品中zui輕組分的沸點(diǎn)，而zui終溫度則則取決于zui重組分的沸點(diǎn)。升溫速率則要依樣品的復(fù)雜程度決定，在具體工作中操作條件的選擇一定要根據(jù)樣品的實(shí)際分離情況來優(yōu)化設(shè)定。
4. 檢測(cè)器溫度是指檢測(cè)器加熱塊溫度而不是實(shí)際檢測(cè)點(diǎn)，如火焰的溫度。
檢測(cè)器溫度設(shè)置原則是保證流出色譜柱的組分不會(huì)冷凝，同是又滿足檢測(cè)器靈敏度的要求。大部分檢測(cè)器的靈敏度受溫度影響不大，故檢測(cè)器溫度可參照色譜柱的zui高溫度設(shè)定。
5. 載氣流速的確定相對(duì)容易一些，開始可按照比*流速（氮?dú)饧s20cm/S、氦氣約25cm/S、氫氣約為30cm/S）高10%來設(shè)定，然后根據(jù)分離情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，原則是既保證待測(cè)物的*分離，又要保證盡可能短的分析時(shí)間，用填充柱時(shí)載氣流速一般設(shè)為30ml/min。
當(dāng)儀器沒有配置電子氣路（EPC）控制時(shí)，必須通過皂膜流量計(jì)或測(cè)定時(shí)間的方法來測(cè)定載氣流速，通過調(diào)節(jié)柱前壓的方式來改變載氣流速，色譜柱越長(zhǎng)，內(nèi)徑越小柱溫越高，需要柱前壓越高。
當(dāng)所用檢測(cè)器需要燃燒氣和輔助氣時(shí)，還要設(shè)定這些氣體的流量。
如FID檢測(cè)器，可設(shè)定為：空氣300—400ml/min、氫氣30—40ml/min
用毛細(xì)柱時(shí)：
尾吹氣（氮?dú)猓┛稍O(shè)為30—40ml/min
4） 分離條件優(yōu)化
分離條件的優(yōu)化是一個(gè)很大的題目，這里只從實(shí)用角度簡(jiǎn)單介紹優(yōu)化方法。這里只強(qiáng)調(diào)操作條件柱溫和載汽流速的優(yōu)化。
事實(shí)上，當(dāng)樣品和儀器配置確定后，一個(gè)色譜技術(shù)人員zui經(jīng)常的工作除了更換色譜柱處就是要改變色譜柱溫度和載氣流速以期達(dá)到*化的分離。柱溫對(duì)分離結(jié)果的影響要比載氣的影響大。
條件優(yōu)化的目的就是在zui短的分析時(shí)間內(nèi)達(dá)到符合要求的分離結(jié)果。所以在初始條件下樣品中難分離物質(zhì)對(duì)的分離度R大于1.5時(shí)。可來用增大載氣流速，提高柱溫或開溫速率的措施來縮短分析時(shí)間，反之亦然。
比較難的問題是確定色譜圖上的峰是否單一組分的峰。可用標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照，如果某一目的峰是兩個(gè)或以上組分的共流出峰，優(yōu)化分離的任務(wù)就比較艱巨了，在改變柱溫和載氣流速也達(dá)不到基線分離的目的時(shí)就應(yīng)更換更長(zhǎng)的色譜柱，甚至更換不同固定相色譜柱，因?yàn)樵?/span>GC中，色譜柱是分離成敗的關(guān)鍵。
5） 定性鑒定
所謂定性，就是確定色譜峰的歸屬，對(duì)于簡(jiǎn)單樣品，可根據(jù)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照用保留值來確定色譜圖上的峰哪個(gè)是要分析的峰。
定性時(shí)必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以對(duì)未知物的定性僅僅用一個(gè)保留數(shù)據(jù)是不夠的，雙柱或多柱保留數(shù)值定性是GC中較為可靠的方法，因?yàn)椴煌衔镌诓煌V柱上具有相同保留值的幾率要小的多。
6） 定量分析
在這一步驟中是要確定用什么定量方法來測(cè)定待測(cè)組分的含量。
常用方法有：峰面積（峰高）百分法，歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法（疊加法）。峰面積（峰高）百分比法zui簡(jiǎn)單也zui不準(zhǔn)確，只做精略定量。
不同化合物在同一條件下，同一檢測(cè)器上的響應(yīng)因子往往不同，故須用標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定響應(yīng)因子進(jìn)行校正后，方可得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，故其他幾種方法均需校正。歸一化法較為復(fù)雜，它要求樣品中所有組分均出峰且要求所有組分的標(biāo)準(zhǔn)品才能定量，故很少采用。外標(biāo)法是采用zui頻繁的方法，只要用一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作出工作曲線（樣品量或濃度對(duì)峰面積或峰高作圖）就可在*一致的條件下對(duì)求知樣品進(jìn)行定量分析，只要待測(cè)組分出峰且分離*即可，而不考慮其他組分是否出峰和分離安全，但是外標(biāo)法定量，分析條件必須重現(xiàn)，特別是進(jìn)樣量。
相比而言，內(nèi)標(biāo)法定量精度zui高，因?yàn)樗窍鄬?duì)于標(biāo)準(zhǔn)物（叫內(nèi)標(biāo)物）的響應(yīng)值來定量的。而內(nèi)標(biāo)物要分別加入到標(biāo)準(zhǔn)樣品和求知樣品中，這樣可抵消由于操作條件（包括進(jìn)樣量）的波動(dòng)帶來的誤差，與外標(biāo)法類似，內(nèi)標(biāo)法只要求待測(cè)組分出峰或*分離即可，其余組分則可用快速升高柱溫使其流出或用反吹法將其放空，這樣就可達(dá)到縮短分析時(shí)間的目的。理想內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和響應(yīng)因子應(yīng)該與待測(cè)物盡可能接近，且要*分離，內(nèi)標(biāo)定量時(shí)，樣品制備過程要多一個(gè)定量加入內(nèi)標(biāo)物的步驟，標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品均要加入一定量的內(nèi)標(biāo)物，因此，只要定量精度要求不高，應(yīng)避免使用內(nèi)標(biāo)法。
至于標(biāo)準(zhǔn)加入法，是在未知樣品中定量加入待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品然后根據(jù)峰面積（或峰高）的增加量來進(jìn)行定量計(jì)算，其制備過程與內(nèi)標(biāo)法類似，但計(jì)算原理則*來自外標(biāo)法。度介于兩者之間。
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