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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：702發(fā)布時(shí)間：2010-10-9
一種在抗體—微珠基質(zhì)上快速捕獲抗原的方法是將抗原溶液與微珠混合，旋轉(zhuǎn)或振蕩制成勻漿。這種方法可使抗原和固相化的抗體之間zui大限度地接觸，是一種促使結(jié)合反應(yīng)快速完成的方法。結(jié)合反應(yīng)完成后，將勻漿裝入層析柱內(nèi)以便收集微珠和洗脫抗原。此法可以很好地控制反應(yīng)時(shí)間，使基質(zhì)上的抗體結(jié)合容量達(dá)到zui充分的利用。這比以上介紹直接用層析柱捕獲抗原的方法稍微麻煩一些。主要是因?yàn)閷驖{裝柱比較困難；另一個(gè)問題是在混勻過程中會增加抗原溶液中變性蛋白的量，所以使用這種方法的本底可能較高。
1．準(zhǔn)備工作
在開始工作前，要考慮裝填微珠的層析柱的類型及大小。如果微珠的柱床體積寬而淺，洗脫的峰形比較清晰，而且比較容易回收，將其貯存于另一個(gè)容器中供下次使用。層析柱太粗的缺點(diǎn)是在更換洗脫緩沖液時(shí)會擾動影響微珠。
2．所需溶液和特殊設(shè)備
結(jié)合緩沖液（通常為PBS）；
搖床；簡便的層析設(shè)備。
3．操作步驟
（1）將抗體—微珠基質(zhì)加入抗原制品內(nèi)。所加微珠的體積應(yīng)通過預(yù)備試驗(yàn)確定，調(diào)整微珠的用量，使其結(jié)合反應(yīng)所需時(shí)間內(nèi)剛好能將所有的抗體分離。微珠的zui終濃度大約為lml濕珠加到10—20ml緩沖液中。
（2）4C孵育微珠—抗原勻漿，并輕輕混合。常用的方法是在一封閉的容器中振蕩或置平板搖床上渦旋混勻。孵育時(shí)間根據(jù)步驟（1）的預(yù)備試驗(yàn)確定。開始試驗(yàn)時(shí)可以先孵育2h。
（3）將微珠勻漿轉(zhuǎn)移到一個(gè)大小合適的層析柱中。將勻漿倒入柱內(nèi)，并用抗原緩沖液洗下混合容器中殘留的微珠，將洗滌液一道加入柱內(nèi)。
（4）用20倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗滌微珠。
此時(shí)制備好的層析柱可進(jìn)行進(jìn)一步洗滌或洗脫。
4．常見問題
這種方法zui大的問題是蛋白質(zhì)非特異地結(jié)合到微珠上。這些蛋白可在洗脫時(shí)出現(xiàn)，從而使純化效率降低。基質(zhì)本身和抗體—基質(zhì)復(fù)合物表面都可以非特異地結(jié)合抗原溶液中的蛋白質(zhì)，盡管這些反應(yīng)一般要比抗體—抗原間的反應(yīng)弱，但在起始的抗原制品中如會有過量的非特異性蛋白就意味著在分離過程中將產(chǎn)生內(nèi)在的高本底。以下幾種方法可使非特異性結(jié)合降到zui低限度。
首先，如同其他親和純化法一樣，所用基質(zhì)的量必須調(diào)整到剛好在其飽和水平之上。保持抗體—微珠基質(zhì)的用量，使非特異性本底盡可能降低。微珠的用量可通過預(yù)試確定，并監(jiān)測不同體積的抗體—微珠基質(zhì)所獲得的抗原量。
第二種方法是降低柱上的非特異性吸附量。許多吸附到柱基質(zhì)上的蛋白質(zhì)是部分或全部變性的蛋白。在制備抗原溶液時(shí)，機(jī)械性用力要盡可能輕。在結(jié)合階段，用機(jī)械振動使微珠保持混懸狀時(shí)，動作亦應(yīng)盡可能輕，并避免過度與空氣接觸。另一種非特異性吸附來自某些異常的小碎片，在將微珠轉(zhuǎn)移到柱中后，可被柱基質(zhì)截留。在將抗原溶液加入微珠之前，先將抗原溶液經(jīng)過100 000g離心30min，可去除制品中大的凝聚物。
第三種降低本底的方法是在裝好柱后用緩沖液洗滌微珠，以去除非特異性蛋白。任何不干擾抗原抗體反應(yīng)的緩沖液都可以用于消除非特異性結(jié)合。詳見表9．5洗滌緩沖液的應(yīng)用。
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