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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：399發(fā)布時(shí)間：2011-7-23
雙向電泳，關(guān)鍵在于建立一套有效、可重復(fù)的樣品制備方法。方法是多種多樣的，不過(guò)都基本遵循以下的原則：
1. 樣品緩沖液中離子濃度的控制
2. 溶解包括疏水蛋白在內(nèi)的所有蛋白質(zhì)
3. 防止聚焦過(guò)程中已溶解蛋白質(zhì)的聚焦和析出
4. 防止樣品制備過(guò)程中及其后蛋白樣品的酶或化學(xué)降解等的修飾反應(yīng)
5. 去除或*降解核酸及其他干擾分子
6. 去除高豐度或不相關(guān)的蛋白質(zhì)，提高低豐度蛋白的濃度，使其達(dá)到檢測(cè)要求
提高分辨率和確保重復(fù)性是雙向電泳實(shí)驗(yàn)zui重要的兩個(gè)目標(biāo)。蛋白樣品制備在實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)目標(biāo)的過(guò)程中起到了核心作用。Bio-Rad公司的ReadyPrep試劑盒通過(guò)試劑增溶或差異溶解來(lái)減少脫尾或降低樣品復(fù)雜性，從而成為用戶可靠的實(shí)驗(yàn)工具。ReadyPrep 產(chǎn)品線包含一系列2-D 樣品制備試劑盒，不僅適用于通用樣品（總蛋白）處理，而且可以將復(fù)雜樣品按特定方法分級(jí)。處理通用樣品的試劑盒包括總蛋白抽提和蛋白凈化（clean-up）。樣品分級(jí)試劑盒可用來(lái)降低樣品復(fù)雜程度，同時(shí)有助于低豐度蛋白的富集和鑒定。這類試劑盒又分為兩種，一種是基于蛋白不同的亞細(xì)胞定位來(lái)分離，另一種是對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分級(jí)，從而適合于總蛋白質(zhì)組分析。
從血清或血漿中提取的低豐度蛋白經(jīng)常會(huì)受到白蛋白和IgG的干擾。白蛋白在血清總蛋白中的含量約為60-70%，IgG雖小，也不可輕視，占了總蛋白的約10-20%。這兩種蛋白異軍突起，常常掩蓋了其它類似大小的蛋白，使我們無(wú)視低豐度蛋白的存在，也降低了雙向電泳的分辨率。因此，在分析目的蛋白之前，我們一定要先干掉白蛋白和IgG這兩個(gè)家伙。
樣品中的核酸會(huì)對(duì)等電聚焦的結(jié)果產(chǎn)生干擾：DNA復(fù)合物在變性條件下發(fā)生解離而使溶液的粘稠度增加，可阻礙蛋白質(zhì)進(jìn)入IPG膠條，并減慢蛋白質(zhì)在膠條中的移動(dòng)速度。DNA也會(huì)與樣品中的某些蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)人工假象和條紋。
具體的解決方案如下：
去除鹽分、去垢劑、脂類、酚類
ReadyPrep 2-D 凈化試劑盒
ReadyPrep 2-D 凈化試劑盒可去除蛋白樣品中的去垢劑、鹽分、小肽、脂類和酚類化合物。這些物質(zhì)會(huì)干擾雙向電泳。本試劑盒含有不受去垢劑、離液劑或其它實(shí)驗(yàn)中常用試劑干擾的沉淀試劑，可充分沉淀樣品蛋白，并保證了蛋白樣品的回收效率和濃度。
去除白蛋白
Aurum Affi–Gel 藍(lán)膠小型試劑盒和層析柱
通過(guò)親和層析，Affi–Gel 藍(lán)膠能去除血清和血漿中90%的白蛋白。
去除白蛋白/IgG
Aurum 血清蛋白Mini試劑盒
Aurum 血清蛋白Mini試劑盒包含了Micro Bio-Spin層析柱，其中填充了Affi-Gel 藍(lán)膠和Affi-Gel Protein A填料。這兩種樹(shù)脂混合物能同時(shí)選擇性地結(jié)合白蛋白和IgG，處理過(guò)的樣品無(wú)需額外純化，就能立即用于2D的分析。一次純化就能搞定兩個(gè)東西，操作步驟減少了，效率也提高了。
去除DNA
zui簡(jiǎn)單的方法就是酶解。當(dāng)樣品用高pH溶液裂解后，在溶液中加入核酸內(nèi)切酶，既能有效降解核酸，又能使內(nèi)源性蛋白酶的活性zui低。也可以在冰浴環(huán)境中，通過(guò)超聲處理的方法將大片段的核酸打斷成小片段后，直接進(jìn)行雙向電泳。
總蛋白抽提
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒 （總蛋白）
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒 （總蛋白） 是一種操作簡(jiǎn)單、快捷、重復(fù)性好的試劑盒，用來(lái)抽提適合于雙向電泳的細(xì)胞全蛋白。試劑盒中離液性*的抽提溶液含有兼性去垢劑ASB-14，從而使該溶液能溶解各種細(xì)胞的全蛋白。
根據(jù)亞細(xì)胞定位分步抽提
ReadyPrep蛋白抽提試劑盒 （膜I）
本試劑盒是利用Triton X-114在一定溫度下可與水相分層的原理將蛋白分離。經(jīng)過(guò)zui后一步的離心步驟，溶液被分級(jí)成上層的水相和下層的高去垢劑相。此外還有一些難溶的沉淀，這些沉淀主要是更加復(fù)雜的膜蛋白。進(jìn)入上下兩相的蛋白再用ReadyPrep 2-D 凈化試劑盒（含在本試劑盒中）凈化，以去除抽提過(guò)程中混入的可能干擾IEF的物質(zhì)。
ReadyPrep蛋白抽提試劑盒 （膜II）
膜II試劑盒做為其它膜蛋白分離試劑盒的補(bǔ)充，是專門(mén)為有效分離較為復(fù)雜的膜蛋白而優(yōu)化的。抽提的過(guò)程用到了碳酸鈉和超速離心機(jī)。試劑盒中的2-D水化/上樣緩沖液含有強(qiáng)離液性的兼性去垢劑ASB-14。
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒（信號(hào)）
絕大多數(shù)細(xì)胞的胞漿膜都有富含神經(jīng)鞘磷脂和*的微區(qū)域（酯筏）。與這些脂筏相的蛋白往往是參與物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)。這類蛋白包括GPI錨訂蛋白、caveolin、caveolae （caveolin-associated proteins）、酰化*激酶、G蛋白異三聚體，以及一些含跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白 （Simons and Ikonen 1997, Brown and Rose 1992, Parton and Simons 1995, Anderson et al. 1992） 。與胞膜當(dāng)中這些富含酯類的微區(qū)域相結(jié)合的蛋白質(zhì)在4°C Triton X-100的溶液中難溶。ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒（信號(hào)） 利用這一原理將信號(hào)蛋白有選擇性地加以回收。
ReadyPrep蛋白抽提試劑盒（胞漿/核）
ReadyPrep蛋白抽提試劑盒（胞漿/核）使用一種專門(mén)配制的緩沖液和差速離心將細(xì)胞核完整地分離出來(lái)（Dignam et al. 1983, Zerivitz and Akusjarvi 1989）。本試劑盒包含一種強(qiáng)離液性的緩沖液，可有效溶解膜蛋白，并可直接用于雙向電泳分離。如要對(duì)胞漿組分進(jìn)行分析可以將蛋白樣品先用試劑盒中帶的ReadyPrep 2-D 凈化試劑盒處理。
根據(jù)不同的溶解度分步抽提
ReadyPrep 順序抽提試劑盒
ReadyPrep 順序抽提試劑盒是為全蛋白質(zhì)組分析而設(shè)計(jì)的。本試劑盒將初始蛋白樣品根據(jù)溶解性的不同分成三個(gè)組分。當(dāng)?shù)鞍椎膩喖?xì)胞定位不能確定時(shí)，本試劑盒還可以用來(lái)搜尋特定的蛋白。 依照溶液溶蛋白能力的增加將蛋白樣品進(jìn)行順序抽提可以溶解更多的蛋白，從而使蛋白質(zhì)組的信息更全面。
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒 （可溶/不可溶）
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒 （可溶/不可溶） 可將細(xì)胞全部蛋白分為兩個(gè)組分——以親水性蛋白為主的可溶性組分和以疏水性蛋白為主的不可溶組分。這種簡(jiǎn)單的分級(jí)方法可有效降低樣品的復(fù)雜性，提高低豐度蛋白的檢測(cè)效率，從而在總體上改善總蛋白質(zhì)組的分離效果。
保持蛋白的還原狀態(tài)
ReadyPrep還原/烷化試劑盒
ReadyPrep還原/烷化試劑盒首先將半*殘基之間的二硫鍵還原，然后將還原出來(lái)的巰基烷化，使得這些基團(tuán)*保持還原狀態(tài)。這樣做有助于防止假蛋白點(diǎn)的出現(xiàn)并能讓IPG膠條中更多的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到第二向的SDS-PAGE膠中。本試劑盒對(duì)分析堿性蛋白質(zhì)特別有效。因?yàn)槟z條堿性部位的DTT容易電離，在電場(chǎng)作用下遷移出IPG膠條，從而使膠條中DTT減少，蛋白質(zhì)二硫鍵重新形成。絕大多數(shù)生物含有較多數(shù)量的堿性蛋白，這類蛋白的pI值高于pH 7。
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