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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：383發(fā)布時(shí)間：2011-8-23
質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是zui常用、zui基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。
實(shí)驗(yàn)材料：含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液。
實(shí)驗(yàn)原理：在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)；
2. 用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床~250 r/min過夜培養(yǎng)；
3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；
4. 加入300 ?l溶液 I振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)*打勻沉淀或碎塊）；
5. 加入300 ?l溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；
6. 加入300 ?l溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；
7. 12000 g離心10分鐘；
8. 吸取800 ?l上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；
9. 12000 g 常溫離心15分鐘；
10. 倒盡上清，加75％乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；
11. 室溫放置或超凈臺(tái)上風(fēng)干DNA；
12. 加40 ?l滅菌超純水或TE溶解；
13. 質(zhì)粒、BAC的質(zhì)量檢測(cè)，于-20℃保存。
附注：質(zhì)粒檢測(cè)
電泳檢測(cè)：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型
吸光值檢測(cè)：采用分光光度計(jì)檢測(cè)260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為*，低于1.8說明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說明有RNA污染。
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