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上海酶聯生物研究所
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閱讀：411發(fā)布時間：2011-10-27
體外檢測淋巴細胞，首先需制備外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），包括了淋巴細胞和單核細胞，常用的方法是葡聚糖*（又稱淋巴細胞分離液）密度梯度離心法。用該法可去除紅細胞、粒細胞等成分，即為PBMC，分離純度可達95%。若需進一步純化其中的淋巴細胞，可將PBMC鋪于培養(yǎng)皿上，由于單核細胞易吸附玻璃，而留于平皿上，收集未吸附的細胞，即為富含淋巴細胞的懸液。若要分離T細胞，可用多種方法，如尼龍毛分離，抗CD3單克隆抗體，也有利用T細胞表面的CD2能結合綿羊紅細胞（SRBC），使其形成花結（E-花結試驗），比重增大，用密度梯度離心法將其與其他細胞分離。若要分離B細胞，可利用B細胞、單核細胞等能吸附尼龍毛的特性，將PBMC通過尼龍毛柱，B細胞吸附于柱上，T細胞被洗脫分離。如應用以下方法，通過檢測淋巴細胞的某些表面標志，又可鑒定出淋巴細胞的類型及比例。
（一） 流式細胞術（flow cytometry） 是借助流式細胞儀（flow cytometer,FCM）對免疫細胞及其他細胞進行快速準確鑒定和分類的技術。流式細胞儀集光學、流體力學、電子學和計算機技術于一體，對細胞作多參數定量測定和綜合分析，包括細胞大小、核型、表面分子種類等。樣品經多種熒光素標記的抗體染色，因熒光素吸收與發(fā)射光譜的波長不同，信號能同時被吸收，因而能同時分析細胞表面多個分子的表達及表達程度?？蓹z測T細胞、B細胞、NK細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等及其比率，CD4+/CD8+T細胞比值，以及白血病、淋巴瘤的免疫學分類。此外，可借光電效應，微滴通過電場時出現不同偏向，因此可分類收集所需的細胞。該技術能以每秒約5 000個細胞的速度無菌收集細胞，一般一次分選純度在95%~98%，而且保持細胞活性，可進一步研究使用。
（二） 磁珠分離法 將已知抗細胞表面標記的抗體交聯于稱為微珠（平均直徑小于1.5μm）的磁性顆粒，與細胞懸液反應后，微珠借抗體結合于相應細胞群或亞群的表面。再將細胞懸液加于一柱內，并置磁場中，因微珠被磁場吸收，將磁珠結合的細胞與磁珠非結合的細胞分開。如利用抗CD4交聯的微珠可將T細胞中的CD4+T細胞與CD8+T細胞分開，從而獲得高純度的CD4+T細胞。
綜上所述，可以看出免疫學技術有很大的*性，可以直接從某些標本中檢出微生物，也就是說應用制備的各種狀態(tài)的抗體測定微生物性抗原，其敏感性可達幾十個微克的水平。分析微生物學及分子遺傳學檢測技術則試圖在傳統(tǒng)的形態(tài)、培養(yǎng)及生化學試驗的基礎上，細胞因子ELISA試劑盒尋求更快速、簡便而特異的新方法，但這些新方法大多仍不能脫離增菌培養(yǎng)的步驟，因為病原菌在病料標本中的數量有限，要適應各種分析方法的要求，在通常情況下，還必須進行培養(yǎng)，才能達到檢測分析的目的?？傊?，由于新技術與電子計算機相結合，大大提高了反應的準確性、敏感性和快速性，常規(guī)檢驗的時間須以天來計算，而新的快速檢驗技術則縮短到以“時”計算，zui快的在一小時內即可報告結果，其準確性與常規(guī)法的相符率可達90%以上。
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