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上海酶聯(lián)生物研究所
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閱讀：429發(fā)布時間：2011-11-23
聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增。在擴增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運而生。
實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR）是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied biosystems公司推出，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，zui后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA（orcDNA）的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA（或cDNA）拷貝數(shù)zui敏感、zui準確的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實時PCR即（Real-time RT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應(yīng)并實時監(jiān)測DNA的放大過程，在擴增的指數(shù)增長期就測量擴增產(chǎn)物，因為擴增指數(shù)增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關(guān)性，從而實現(xiàn)定量檢測。RealTime PCR的基本目標是測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測CT值而實現(xiàn)對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法zui大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現(xiàn)DNA/RNA的定量。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗及臨床醫(yī)學(xué)研究方面有著重要的意義。
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