污水處理設(shè)備 污泥處理設(shè)備 水處理過濾器 軟化水設(shè)備/除鹽設(shè)備 純凈水設(shè)備 消毒設(shè)備|加藥設(shè)備 供水/儲(chǔ)水/集水/排水/輔助 水處理膜 過濾器濾芯 水處理濾料 水處理劑 水處理填料 其它水處理設(shè)備
上海酶聯(lián)生物研究所
會(huì)員1.png)
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：442發(fā)布時(shí)間：2011-12-14
免疫共沉淀和親和層析共分離：
免疫共沉淀是證明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的zui直接zui經(jīng)典和zui有效的方法，如蛋白A能與B相互作用結(jié)合成異源二聚體，無(wú)論用抗A或抗B的抗體或與A或B的親和物偶聯(lián)的agarose小珠都能把A和B沉淀下來(lái)。因此廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用研究。
常用的小珠：
GST-Agarose（不需要抗體）
ProteinA-Agarose（用時(shí)需加抗體）
基本方法：
1.表達(dá)蛋白質(zhì)A
2.蛋白質(zhì)A與親和小珠結(jié)合
3.用結(jié)合有蛋白質(zhì)A的親和小珠調(diào)取細(xì)胞破碎液中蛋白質(zhì)B
4.離心、洗滌親和小珠若干次
5.處理親和小珠使蛋白質(zhì)A、B解吸附（可以直接用SDS-PAGE上樣BUFFER煮）
酵母雙雜交系統(tǒng)
基本原理，以酵母S.cerevisiae的轉(zhuǎn)錄因子GAL4系統(tǒng)為例
GAL4有兩個(gè)結(jié)構(gòu)上互相分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
N 端1-147aa與DNA結(jié)合（DNA binding domain,BD）。
C端768-881aa能激活轉(zhuǎn)錄（Activation Domain,AD）。
BD＋AD—能激活GAL4效應(yīng)基因的上游激活序列（UAS）。
把N和C分開分別構(gòu)建成兩種表達(dá)質(zhì)粒。如把Gal4的N端和誘餌蛋白（研究的目標(biāo)蛋白A）融合表達(dá)，把細(xì)胞cDNA和C端融合表達(dá)，cDNA編碼的蛋白x如能和A互相作用,就能把Gal4N端C端和N端在一起，就可以激活UAS下游的基因表達(dá)。
半乳糖苷酶（Laz）基因克隆到URA3的下游。
在x-Gal的存在下酵母菌落成藍(lán)色（Fields）
酵母GAL4基因缺失；GAL80基因缺失（GAL4的負(fù)調(diào)控因子）
方法略
假陽(yáng)性多，因此還必須再用免疫共沉淀等直接證據(jù)證明
發(fā)展：哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)、二倍體雙雜交系統(tǒng)、酵母單雜交系統(tǒng)、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)、酵母三雜交系統(tǒng)
FAR WESTERN
Western blot 是免疫印記，而Far western 是蛋白質(zhì)鋪蓋技術(shù)，兩者其實(shí)在本質(zhì)上是相似的，只是免疫印記是直接用抗體去檢測(cè)抗原，常用于蛋白質(zhì)定性；而Far western則是用標(biāo)記的蛋白（125I或熒光）去probe與之相互作用的蛋白，或再用抗這種蛋白的抗體顯示這種蛋白的結(jié)合位置，用于研究蛋白質(zhì)的相互作用。
基本步驟：
1.表達(dá)和提純獲得蛋白A，并作熒光或放射性標(biāo)記，或制備抗A抗體
2.細(xì)胞總蛋白SDS-PAGE（一起染色，另一塊轉(zhuǎn)膜）
3.電轉(zhuǎn)膜
4.封閉
5.加入蛋白A，如A帶標(biāo)記，洗膜后直接顯影；如未標(biāo)記，可加抗A抗體再加二抗或標(biāo)記的蛋白A。
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)
缺點(diǎn)：SDS-PAGE影響蛋白質(zhì)構(gòu)象，可能影響相互作用
表面等離子共振（SPR）法原理：SPR法是生物科學(xué)、物理學(xué)和計(jì)算科學(xué)結(jié)合的方法，在玻璃表面鍍上一層金薄膜，再把目標(biāo)蛋白通過氨基共價(jià)偶聯(lián)在金膜表面制成傳感芯片。當(dāng)一束偏振光照射到傳感芯片的金膜時(shí)會(huì)引起金屬中的電子共振，而導(dǎo)致反射光會(huì)在一定角度內(nèi)大大減弱，其中反射光*消失的角度稱為共振角。共振角會(huì)隨著金膜表面通過的液相的折射率的改變而改變，而折射率的改變又與結(jié)合在金膜表面的生物大分子的質(zhì)量成正比，每結(jié)合1ng/mm2折射率的變化相當(dāng)于1000RU（共振單位），如果通過的液相中有能與膜表面偶聯(lián)的靶蛋白相互作用而結(jié)合的蛋白質(zhì)或其它化學(xué)物，就使結(jié)合在金膜表面的生物大分子質(zhì)量增加，檢測(cè)的共振單位（RU）也增加。通過光檢測(cè)單元檢測(cè)反射光的變化，經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理后，獲得實(shí)時(shí)傳感圖。特點(diǎn)： 1.靈敏度，所需樣品少（20μl就可分析）2.可以同時(shí)確定互相作用動(dòng)力學(xué)參數(shù)Ka、Kd值3.可以測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用，也可測(cè)蛋白質(zhì)與共它分子互相作用（小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖、類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞）（4）可以回收結(jié)合的蛋白進(jìn)一步研究和鑒定（如質(zhì)譜分析）SPR分析的條件控制：樣品制備：樣品的PH、離子強(qiáng)度，對(duì)相互作用有顯著影響，一般PH范圍在6.8-7.8之間，低離子強(qiáng)度，樣品中蛋白質(zhì)濃度變化影響不大，樣品體積20-50μl。溫度：一般25℃+5℃，溫度高于30℃對(duì)相互作用有影響進(jìn)流速：全程流速恒定，進(jìn)樣速度不宜過快，保證接觸時(shí)間，一般進(jìn)樣速度5-10μl/分所需儀器：生物分子相互作用儀（如Biocore X型）分析軟件：如BLAevaluation（Version3.1）軟件。
商鋪：http://www.kytsldc.cn/st32881/
主營(yíng)產(chǎn)品：ELISA試劑盒，人ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒，豚鼠ELISA試劑盒，兔ELISA試劑盒，羊ELISA試劑盒，牛ELISA試劑盒，雞ELISA試劑盒，鴨ELISA試劑盒，植物ELISA試劑盒
環(huán)保在線 設(shè)計(jì)制作，未經(jīng)允許翻錄必究 .? ? ?
請(qǐng)輸入賬號(hào)
請(qǐng)輸入密碼
請(qǐng)輸驗(yàn)證碼
請(qǐng)輸入你感興趣的產(chǎn)品
請(qǐng)簡(jiǎn)單描述您的需求
請(qǐng)選擇省份