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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：559發(fā)布時間：2012-1-4
堿性成纖維細胞生長因子，bFGF）是一種重要的多肽生長因子，也是FGF家族中原型成員之一。從1974年Gospodarowicz等［1］從牛腦中分離出FGF以來，近二十多年研究表明，bFGF在促進血管生成［2］、創(chuàng)傷愈合［3］、骨骼修復(fù)［4］、神經(jīng)營養(yǎng)與修復(fù)［5］、眼晶體再生［6］以及胚胎的發(fā)育與分化［7］方面均顯示出生物學(xué)活性。近年研究發(fā)現(xiàn)bFGF在惡性腫瘤組織中有強烈表達，并與腫瘤病理分級、分期呈正相關(guān)，同時血清中bFGF水平亦明顯增高，這提示bFGF表達增強與腫瘤惡性程度增高、侵襲力增強有密切關(guān)系，可作為惡性腫瘤的早期診斷與預(yù)后指標［8］。因此，制備bFGF抗體對建立免疫學(xué)技術(shù)定量分析，研究阻斷bFGF在體外、體內(nèi)的促細胞增殖作用，抑制腫瘤血管形成作用及阻止腫瘤惡性轉(zhuǎn)化與發(fā)展都有十分重要的意義。本文就近年來在bFGF抗體的制備、鑒定及應(yīng)用等方面的研究進展作一綜述。（basic fibroblast growth factor
一、bFGF抗體的制備［9，10，19］
應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)和細胞融合技術(shù)，人們已成功制備出鼠源和兔源的bFGF抗體。
（一）bFGF單克隆抗體的制備 常用抗原為牛bFGF或人bFGF。根據(jù)融合細胞的不同，bFGF單克隆抗體的制備方法可分為兩種：
1.脾細胞融合制備bFGF單克隆抗體 將1 mg牛bFGF抗原溶于5 mL生理鹽水中，與等體積的弗氏*佐劑雙推法混勻，經(jīng)腹部皮下多點注射免疫雌性BALB/C小鼠（體重18～20 g），抗原用量每只8μg/0.3 mL。2周后用等量抗原與不*佐劑混勻后同上述方法免疫。再過1周后連續(xù)每周用bFGF加強免疫1次（每只10μg/0.1mL），共3次。zui后一次免疫3 d后，取免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞按1∶1.8在0.7 mL 50% PEGMW 2000中融合，分置于已加有腹腔細胞3×104～4×104/孔的96孔板HAT培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。3 d后換液，7 d后可見雜交瘤細胞穩(wěn)定生長，14 d后開始取雜交瘤上清篩選陽性細胞株。
2.淋巴細胞融合制備bFGF單克隆抗體 將1 mg人bFGF抗原溶于5 mL生理鹽水中，取0.5 mL與等體積的弗氏*佐劑超聲乳化，自足墊部注射4～6周雌性BALB／C小鼠，雙足墊免疫至足部腫脹為宜。2周后用等量抗原與不*佐劑混勻后同上述方法免疫。1周后連續(xù)每周用bFGF加強免疫1次（淋巴結(jié)直接注射），共3次。zui后一次免疫3 d后，取免疫小鼠淋巴細胞與SP2/0細胞按1∶2～4在1 mL 50% PEG-4000中融合，分置于已加有腹腔細胞3×104～4×104/孔的96孔板HAT培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。1周后半量換液。換液3～4 d后可見雜交瘤細胞穩(wěn)定生長，1周后開始取雜交瘤上清篩選陽性細胞株。
?。ǘ゜FGF抗血清的制備
1.鼠抗血清的制備 同（一）中的1.或2.法免疫小鼠，將免疫好的小鼠眼眶放血收集抗血清。
2.兔抗血清的制備 將弗氏*佐劑與bFGF抗原混合制成乳狀液體免疫家兔，共8次，當效價達到1∶2000時，頸動脈放血收集抗血清。
二、bFGF單克隆抗體的篩選與鑒定［9,10］
?。ㄒ唬゜FGF單克隆抗體的篩選與克隆化 雜交瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中生長形成克隆后，其中僅少數(shù)是分泌bFGF單克隆抗體的細胞，而且多數(shù)培養(yǎng)孔中有多個克隆生長，分泌的抗體也可能不同。因此，必須進行篩選和克隆化。
1.bFGF單克隆抗體的篩選 要求所測抗體的方法高度靈敏、快速、特異，且便于大量檢測。常用的方法有間接ELISA法、間接血凝試驗、放射免疫測定、免疫酶斑點實驗等。
（1）反向間接血凝試驗 向各孔加入25μL生理鹽水，用稀釋棒蘸取各待測上清依次轉(zhuǎn)動稀釋。同時，用小鼠抗bFGF抗體作為陽性對照，HAT*培養(yǎng)液為陰性對照；再向各孔加入25μL 0.5%的兔抗小鼠IgG、IgM致敏SRBC，在微型震蕩器上震1 min，37℃3 h后觀察結(jié)果。
（2）間接ELISA檢測bFGF抗體 以0.01 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液包被bFGF抗原，每孔100 ng/μL，其余按常規(guī)方法進行。1∶200 PBS-T稀釋鼠抗bFGF為陽性對照，未被免疫的正常小鼠血清作為陰性對照。OD值高于陰性3～10倍者為陽性雜交瘤。
2.雜交瘤細胞克隆化 為防止無關(guān)克隆的過度生長，對陽性孔需進一步克隆化。常用方法有：有限稀釋法、軟瓊脂法、顯微挑選法等。
?。ǘ゜FGF單克隆抗體的鑒定
1.效價測定 采用間接ELISA法和反向間接血凝試驗。
2.Western blot 對純化的牛及人bFGF抗原進行非還原性SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，按Western blot試劑盒中說明書進行雜交。
3.斑點免疫法 將不同濃度的bFGF點于NC膜上，冷風(fēng)干燥后，重復(fù)點樣共20μL/點，余按Western blot方法進行封閉、漂洗、加樣和顯色。
4.中和抗體試驗 將對數(shù)生長期的3T3細胞按5?000個細胞/100μL，加入96孔板中，用120 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。陰性對照孔加入10 ng的bFGF/孔；實驗孔加入1∶102～1∶106稀釋的bFGF單克隆抗體與1 mg/L的bFGF中和后的bFGF10 ng/孔；空白對照以含0.4%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液代替。連續(xù)培養(yǎng)36 h后，于顯微鏡下觀察細胞數(shù)量及生長狀況。
三、bFGF抗體的應(yīng)用
?。ㄒ唬┯糜赽FGF的定量分析 bFGF臨床起效劑量甚微，在1 ng/mL下即可發(fā)揮生理作用，其作為藥品的常規(guī)用量亦多在數(shù)百納克至幾十微克間，經(jīng)典的蛋白質(zhì)測定方法已無法檢測到。馮等［11］結(jié)合常規(guī)ELISA法，用兔抗bFGF抗體作為*抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG作為第二抗體、2,2′-連氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉磺酸）（2,2′-azino-di-（3-ethylbenzthi azoline sulfonate）, ABTS）為底物，自行研制、開發(fā)了一套bFGF檢測試劑盒，建立了快速、準確定量分析微量bFGF的方法。此法可用于生產(chǎn)過程中對制品進行質(zhì)量控制，對含有bFGF藥物成品的質(zhì)量監(jiān)控以及臨床上對bFGF的檢測。
?。ǘ┯糜赽FGF的定位檢測 Schulze Osthoff等［12］應(yīng)用間接免疫過氧化物酶技術(shù)，通過親和純化的高度專一性抗血清檢測了大量的人正常的、炎癥的和腫瘤組織上的bFGF，以確定其在細胞中的分布。他們發(fā)現(xiàn)：在正常的胸腺、胎盤組織，特別是樹突細胞中含有bFGF，在皮膚活體組織的基底細胞和腺體內(nèi)皮細胞也有高水平表達，在這些部位的慢性炎癥組織中相應(yīng)的纖維細胞和內(nèi)皮細胞也明顯增生。在腫瘤組織，浸潤性細胞和內(nèi)皮細胞優(yōu)勢產(chǎn)生bFGF。Yamamoto等［13］用anti-bFGF抗體在鼠視網(wǎng)膜損傷恢復(fù)中對bFGF進行免疫組化定位，發(fā)現(xiàn)bFGF在氪激光致凝損傷中心增生的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞細胞核和細胞質(zhì)，以及損傷周圍的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞核，均有免疫活性。Reilly等［14］用體細胞融合技術(shù)產(chǎn)生了一個bFGF單克隆抗體DG2，作為一種功能性抗體，它在檢測bFGF對細胞生長、發(fā)育、增殖等生理過程的作用具有重要意義，在bFGF免疫分析、免疫組化研究方面具有廣泛的應(yīng)用。
?。ㄈ┓蛛x純化bFGF Massogllia等［15］開發(fā)出了6、8、38、42等4種bFGF單克隆抗體，以識別牛bFGF的完整的或失去氨基末端的結(jié)構(gòu)，bFGF單克隆抗體8、42已被用于兩步ELISA以發(fā)現(xiàn)bFGF的完整結(jié)構(gòu)。這種ELISA對38.5 fmole/well的bFGF很敏感，而且不會被牛腦中的酸性成纖維細胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）影響。這些bFGF單克隆抗體可被用于區(qū)別天然的和去除1～15氨基酸的bFGF，并能把bFGF和aFGF及其他的生長因子區(qū)分開。
?。ㄋ模┮种芺FGF生物活性 近年來，隨著bFGF及其抗體研究的深入，發(fā)現(xiàn)通過抑制bFGF生物活性從而抑制某些組織病變，阻斷疾病的發(fā)生發(fā)展，為一些疾病的治療提供了新的方法。
1.治療視網(wǎng)膜增生 視網(wǎng)膜增生是糖尿病患者常見并發(fā)癥。Morisaki等［16］從內(nèi)皮細胞和外膜細胞的相互作用以及外膜細胞的顯型改變闡明了視網(wǎng)膜增生免疫療法的機制。他們克隆培養(yǎng)了正常和患糖尿病兔視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞和外膜細胞，發(fā)現(xiàn)在體外，來自于正常兔的外膜細胞條件培養(yǎng)基對患糖尿病兔內(nèi)皮細胞血管生成的刺激作用大于正常的內(nèi)皮細胞，而bFGF和轉(zhuǎn)型生長因子β1（transforming growth factor-beta 1,TGF β1）對糖尿病患者內(nèi)皮細胞血管生成的刺激也大于正常的內(nèi)皮細胞。這表明，糖尿病患者內(nèi)皮細胞增殖速度大于正常的內(nèi)皮細胞。而來自糖尿病兔的外膜細胞條件培養(yǎng)基，對正常內(nèi)皮細胞血管生成的刺激作用大于正常兔外膜細胞條件培養(yǎng)基，則說明糖尿病患者外膜細胞比正常外膜細胞分泌出更多的血管生成因子。上述結(jié)果說明，糖尿病患者視網(wǎng)膜增生是由于內(nèi)皮細胞和外膜細胞的相互作用及糖尿病患者內(nèi)皮細胞和外膜細胞的顯型改變引起的。他們同時還發(fā)現(xiàn)來自正常和患糖尿病兔的外膜細胞條件培養(yǎng)基的血管生成作用、促有絲分裂作用和遷移活性均同樣地被anti-bFGF抗體抑制，這為應(yīng)用anti-bFGF抗體治療糖尿病患者視網(wǎng)膜增生提供了有力的依據(jù)。
2.治療肌內(nèi)膜增生 肌內(nèi)膜增生是動脈重建手術(shù)中常見并發(fā)癥。Randone等［17］研究了聚四氟乙烯動脈移植后anti-bFGF多克隆抗體對平滑肌增生的抑制作用。他們發(fā)現(xiàn)聚四氟乙烯移植后，在結(jié)合部位和移植部位bFGF對平滑肌細胞增生起著主要作用，anti-bFGF多克隆抗體能抑制bFGF活性，可用于抑制肌內(nèi)膜增生的形成。Cucina等［18］發(fā)現(xiàn)*蛋白*在血管壁的愈合及肌內(nèi)膜增生zui終形成中具有主要作用，它刺激平滑肌細胞釋放出更多的bFGF而引起肌內(nèi)膜增生，anti-bFGF抗體可抑制*促有絲分裂作用，從而阻斷肌內(nèi)膜增生的形成。
3.治療矽肺纖維化 矽肺是矽塵作業(yè)中常見、多發(fā)的重要職業(yè)病，至今仍無有效療法。劉凱珊等［19］根據(jù)矽肺病變規(guī)律，針對成纖維細胞是纖維化的關(guān)鍵和巨噬細胞能夠釋放bFGF而刺激成纖維細胞增生的重要環(huán)節(jié)，采用抗bFGF血清中和bFGF，減少成纖維細胞的增生，從而阻斷病變的發(fā)生發(fā)展。
4.治療腎癌 腎癌是一種富含血管的腫瘤，血管形成是腫瘤生長、侵襲甚至轉(zhuǎn)移所必需的。bFGF作為血管形成因子不但能促進腫瘤血管形成，還具有介導(dǎo)腫瘤生長的作用［20］，在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中已受到人們的重視。Mydlo等［21］研究發(fā)現(xiàn)腎癌組織中可提取分離出bFGF，其能夠促進腎癌細胞增殖；Fujimoto等［22］報道了腎癌病人血清中bFGF含量增高，進一步表明腎癌能夠合成及分泌bFGF，其水平與腫瘤病理分級、分期呈正相關(guān)。這些說明bFGF在腎癌細胞增殖和血管形成等方面起著重要作用。Emoto等［23］發(fā)現(xiàn)bFGF抗體能夠抑制腎癌細胞生長；Reilly等［14］發(fā)現(xiàn)anti-bFGF抗體DG2對體外培養(yǎng)的幼倉鼠腎臟內(nèi)皮細胞上bFGF位點具有高度親和力，對一個血管發(fā)生的鼠腎內(nèi)體模型中bFGF對血管生成的應(yīng)答具有高度抑制性；Emoto等［24］也報道bFGF抗體可*抑制腎癌細胞微血管內(nèi)皮細胞血管形成。這些研究成果為腎癌的治療提供了新的思路。
5.治療膀胱癌 在膀胱癌組織中，bFGF表達顯著高于正常組織。bFGF可增強膀胱癌腫瘤微血管形成能力及腫瘤細胞增殖能力，bFGF異常表達是膀胱癌腫瘤生長快、惡性程度高、浸潤深入易復(fù)發(fā)的重要因素之一［25，26］。實驗表明bFGF抗體能夠抑制腫瘤生長，這為今后膀胱癌治療提供了新的途徑［27］。
6.治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤 bFGF對來自神經(jīng)外胚層和中胚層的細胞具有促有絲分裂作用，可促進細胞的增殖和血管的形成，其在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞中高水平表達，可能與膠質(zhì)瘤的進展有關(guān)［28，29］。Nemati等［30］應(yīng)用抗bFGF免疫療法，發(fā)現(xiàn)bFGF抗體在無胸腺裸鼠模型中抑制血管的發(fā)生和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長。Murai等［29］應(yīng)用抗人bFGF中和抗體誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞編程性死亡，這是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一種很有前途的方法。
四、展望
隨著bFGF研究的不斷深入，它在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，因此應(yīng)用bFGF抗體技術(shù)純化、檢測bFGF亦愈來愈受到重視。特別是近來發(fā)現(xiàn)bFGF在一些腫瘤細胞中有顯著表達，是一些腫瘤的標志物，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，因此抗bFGF單克隆抗體的研制，將為國內(nèi)開展對腫瘤的診斷、治療，以及研究bFGF與腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的關(guān)系，提供重要的試劑，而應(yīng)用bFGF免疫療法也為一些疾病的預(yù)防和治療提供了新的途徑和方向。針對目前鼠源、兔源抗體臨床治療存在的免疫源致敏反應(yīng)問題，已有研究人員致力于人源抗體的開發(fā)，這將成為bFGF抗體研究的一個新的起點。
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