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上海酶聯(lián)生物研究所
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凝集反應(yīng)是指細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面覆蓋抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在的條件下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。
一、直接凝集反應(yīng)
顆粒性抗原(如細(xì)菌、紅細(xì)胞等)直接與相應(yīng)特異性抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱直接凝集反應(yīng)。參加的抗原稱為凝集原，而抗體則稱為凝集素。直接有玻片法和試管法兩類。
(一)玻片
在玻片上進(jìn)行的直接,主要用于抗原的定性分析,數(shù)分鐘之內(nèi)便可觀察結(jié)果,快速、簡便。常用于細(xì)菌的分型鑒定,也用于ABO血型的測定。
【 實(shí)驗材料 】
( 1)抗原：受檢菌液或受檢者的血細(xì)胞鹽水懸液。
( 2)抗體：用于細(xì)菌鑒定的1：20稀釋診斷血清。
血型檢測的A及B診斷血清。
( 3)生理鹽水、玻片、吸管、接種環(huán)。
【 實(shí)驗方法 】
( 1)于潔凈玻片的一端加診斷血清1滴，另一端加生理鹽水1滴作陰性對照。
( 2)用接種環(huán)取待檢菌液或血細(xì)胞懸液分別涂于診斷血清和生理鹽水，混勻。
( 3)輕搖玻片，靜置數(shù)分鐘，觀察結(jié)果。
【 結(jié)果分析 】
玻片上抗原凝集成肉眼可見的小團(tuán)塊狀或絮狀凝集物，其周圍液體澄清，為陽性反應(yīng)。陰性反應(yīng)和生理鹽水對照均不發(fā)生凝集，為均勻混濁的乳狀液。
【 注意事項 】
細(xì)菌鑒定時，特別是腸道菌種的沙門菌屬或志賀菌屬，原則上先用多價診斷血清檢測，如為陽性，再用單價診斷血清進(jìn)行分群或定型。血型測定時，室溫需保持在 20oC左右，若低于10oC，易出現(xiàn)冷凝集現(xiàn)象而造成假陽性的錯誤診斷。
(二)試管
是用定量的顆粒性抗原懸液與一系列倍比稀釋的待檢血清在試管中進(jìn)行的，根據(jù)試驗結(jié)果判定待檢血清中有無相應(yīng)抗體及其效價，對血清中抗體進(jìn)行半定量分析。此法目前仍常用于某些病原微生物感染的免疫學(xué)診斷，例如，診斷傷寒和副傷寒的肥達(dá)氏( Widal test)反應(yīng)，診斷斑疹傷寒的外—裴氏反應(yīng)(weil-felix test)。
【 實(shí)驗材料 】
診斷菌液, 1:10稀釋的待檢血清，生理鹽水，小試管，刻度吸管，試管架，恒溫水浴箱。
【 實(shí)驗方法 】
(1)稀釋待檢血清取8支試管排列于試管架上,依次編號,每管加入0.5ml生理鹽水。于第1管中加入0.5ml待檢血清,充分混勻后,吸出0.5ml加入第2管,同法混勻后又吸出0.5ml加入第3管,依次類推,連續(xù)稀釋至第7管,zui后從第7管中吸出0.5ml棄去。第8管為生理鹽水對照管。
(2)于各管中加入診斷菌液0.5ml,振搖試管架，充分混勻。
試管操作程序
(3)將試管靜置于37oC恒溫水浴箱中40min。
【 結(jié)果分析 】
( 1)首先觀察陰性對照管，應(yīng)無凝集現(xiàn)象，管底沉積呈圓形，邊緣整齊，輕輕搖動則沉積菌分散均勻呈混濁現(xiàn)象。
• 觀察實(shí)驗管，凝集現(xiàn)象可根據(jù)強(qiáng)弱程度，分為五級：
++++ 細(xì)菌全部凝集，管底形成大片凝集物。
+++ 細(xì)菌大部分凝集，管底的片狀凝集物較小而薄。
++ 約半數(shù)的細(xì)菌發(fā)生凝集，管底出現(xiàn)凝集環(huán)。
+ 僅有少部分細(xì)菌凝集，管底可見沉積的細(xì)菌周邊有稀疏、點(diǎn)狀的凝集物。
— 液體混濁，無凝集。
( 3)血清抗體效價的判定：以出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象(++)的血清zui高稀釋度作為受檢血清的抗體效價。
【 注意事項 】
實(shí)驗中應(yīng)注意反應(yīng)體系的溫度、電解質(zhì)濃度及酸堿度( pH值)。
二、間接
將可溶性抗原(或抗體)先吸附在一種與免疫無關(guān)，一定大小的載體顆粒表面成為致敏載體顆粒，然后與相應(yīng)抗體(或抗原)結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)肉眼可見的特異性凝集現(xiàn)象，稱間接，此法敏感度比直接高，因而廣泛地應(yīng)用于臨床檢測中，間接中常用的載體顆粒有人 “ O”型紅細(xì)胞、動物紅細(xì)胞、活性炭或硅酸鋁顆粒，聚苯乙烯乳膠微球等。
(一)正向間接血凝試驗
將綿羊紅細(xì)胞或人的“ O”型紅細(xì)胞用醛類固定(稱為醛化，可改變血球表面性質(zhì)，使其易于吸附蛋白質(zhì)類抗原，并可長期保存使用)，再將可溶性抗原吸附于醛化的血細(xì)胞上，制成抗原致敏的紅細(xì)胞，當(dāng)與相應(yīng)的抗體結(jié)合，使紅細(xì)胞被動的聚合在一起，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，常用于檢測傳染病抗體或自身抗體。
【 實(shí)驗材料 】
( 1)抗原制備：將傷寒桿菌接種在培養(yǎng)基上，37oC培養(yǎng)24小時，用生理鹽水洗下，100oC水浴2小時，離心棄上清，稀釋后備用。
( 2)致敏紅細(xì)胞的制備：取稀釋的抗原與等體積的已醛化的2%SRBC混合，37oC水浴2小時，每隔15分鐘振搖一次，取出后洗滌棄上清，稀釋成0.5%備用。
( 3)試管、試管架、刻度吸管、恒溫水浴箱。
【 實(shí)驗方法 】
( 1)取8支小試管排列于試管架上，依次編號。每管加入0.25ml生理鹽水。于第1管內(nèi)加入1:10稀釋的免疫血清0.25ml混勻，倍比稀釋至第7管。第8管為陰性對照。
( 2)每管中加入0.25ml致敏綿羊紅細(xì)胞，振搖試管架，使之充分混勻。
( 3)將試管架靜置于37oC恒溫水浴箱中1小時。
正向間接血凝試驗操作程序
【 結(jié)果分析 】
( 1)首先觀察陰性對照管，應(yīng)無凝集現(xiàn)象，管底紅細(xì)胞沉積呈圓形，邊緣整齊，輕輕搖動則沉積菌分散均勻呈混濁現(xiàn)象。
( 2)觀察實(shí)驗管，凝集現(xiàn)象可根據(jù)強(qiáng)弱程度，分為五級：
++++ 細(xì)菌全部凝集，管底形成大片凝集物。
+++ 細(xì)菌大部分凝集，管底的片狀凝集物較小而薄。
++ 約半數(shù)的細(xì)菌發(fā)生凝集，管底出現(xiàn)凝集環(huán)。
+ 僅有少部分細(xì)菌凝集，管底可見沉積的細(xì)菌周邊有稀疏、點(diǎn)狀的凝集物。
— 液體混濁，無凝集。
( 3)血清抗體效價的判定：以出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象(++)的血清zui高稀釋度作為受檢血清的抗體效價。
【 注意事項 】
• 紅細(xì)胞需來自同一個體、批號相同，且致敏血球應(yīng)新鮮配置。
• 使用器材必須清潔，否則對結(jié)果有很大影響。
(二)反向間接血凝試驗
將特異性抗體吸附于醛化的紅細(xì)胞上，再與相應(yīng)抗原結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在條件下，紅細(xì)胞被動聚集出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象。用于檢測標(biāo)本中的相應(yīng)可溶性抗原。
【 實(shí)驗材料 】
( 1)1:20抗—HBs致敏的醛化血球、純化的1:20抗—HBs、待檢血清、稀釋液。
( 2)“V”型微量血凝板，0.025ml稀釋棒、微量攪拌器、刻度吸管、滴管(40滴/ml)。
【 實(shí)驗方法 】
( 1)配制致敏血球懸液 于每瓶凍干診斷血球加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻血球懸液，濃度約為0.6%。
( 2)正式試驗
① 在“V”型微量血凝板上，每份待檢血清設(shè)立8孔，于各孔內(nèi)用40滴/ml滴管各加1滴稀釋液(相當(dāng)于0.025ml)。
② 用0.025ml容量的稀釋棒蘸滿待檢查血清分別依次在各孔內(nèi)捻轉(zhuǎn)作倍比稀釋(一般每孔內(nèi)均需捻轉(zhuǎn)10次左右)，直至第7孔，第8孔為致敏血球?qū)φ铡Ａ碓O(shè)第9孔為陽性對照，加0.025mlHBsAg陽性血清。
③ 于每孔中加0.025ml混勻的致敏血球懸液。
④ 將血凝板置于微型振蕩器上振蕩1~2分鐘，置37oC1小時后觀察結(jié)果。
反向間接血凝試驗操作程序
【 結(jié)果分析 】
不凝集：紅細(xì)胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點(diǎn)。
明顯凝集(++)：紅細(xì)胞于孔底形成薄膜狀凝集，*可見疏松的紅點(diǎn)。
出現(xiàn)明顯凝集的血清zui高稀釋度為 HBsAg效價，凡效價≥1:16者需進(jìn)一步做中和試驗。
中和試驗
在血凝板上每份標(biāo)本設(shè)測定排與對照排，每排 8孔。于每孔加稀釋液0.025ml，用2支稀釋棒蘸取被檢血清，分別在2排作倍比稀釋到第7孔，第8孔不含血清，為血球?qū)φ?，然后，于測定排各孔加稀釋液0.025ml，對照排各孔加1:20抗HBsAg0.025ml，血凝板振蕩1~2分鐘，置37oC30分鐘。取出，于各孔加0.025ml致敏血球，振搖混勻，置37oC1小時后觀察結(jié)果。
凡正式試驗效價≥ 1:16，且中和試驗的對照排凝集孔數(shù)至少低于測定排凝集孔數(shù)2孔者，為HBsAg陽性，否則系非特異性凝集。
【 注意事項 】
( 1)配制的致敏血球懸液一般當(dāng)天用完，若置2~10oC，使用期不超過3天。
( 2)試驗用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。
• 血凝板、稀釋棒用后均需用次氯酸鈉( 10%v/v)浸泡過夜；滴管需煮沸10分鐘，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。
商鋪：http://www.kytsldc.cn/st32881/
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