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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：245發(fā)布時(shí)間：2012-11-2
的基因組參照序列對(duì)微生物研究者來(lái)說(shuō)具有很高的價(jià)值。因此，研究人員進(jìn)行了經(jīng)年累月的繁復(fù)實(shí)驗(yàn)和復(fù)雜的計(jì)算，迄今已完成了約1800種細(xì)菌的基因組裝配。日前，美國(guó)哈佛-麻省理工博德研究所的研究人員應(yīng)用新方法，結(jié)合了shotgun鳥(niǎo)槍法全基因組測(cè)序、單分子測(cè)序和自動(dòng)化計(jì)算軟件，對(duì)16個(gè)細(xì)菌樣本進(jìn)行了高質(zhì)量的基因組裝配，得到了品質(zhì)的完成基因組。這一方法極大的減少了完成基因組裝配所花費(fèi)的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。該文章發(fā)表在Genome Research雜志上。盡可能的了解基因組信息對(duì)于微生物學(xué)研究有著基礎(chǔ)性的意義。使用大規(guī)模平行測(cè)序的短讀序數(shù)據(jù)進(jìn)行de novo從頭裝配，這在過(guò)去曾被認(rèn)為是不可能完成的任務(wù)，而現(xiàn)在終于可以借助新興技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。
自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法所生成的基因組裝配具有優(yōu)良的品質(zhì)，在某些情況下輔以少量的人工實(shí)驗(yàn)，就能夠得到近乎完成的基因組。然而不論是在Sanger測(cè)序的年代還是在目前的短讀序時(shí)代，大多數(shù)基因組裝配都存在諸多錯(cuò)誤和缺口。重要的是，基因組裝配zui困難（快速進(jìn)化）的區(qū)域常常缺失或者產(chǎn)生錯(cuò)誤。幸運(yùn)的是，細(xì)菌的基因組很?。ㄒ话?-6Mb），因此在許多情況下都能夠通過(guò)額外的工作進(jìn)行校正。目前，通過(guò)測(cè)序結(jié)合人工實(shí)驗(yàn)和計(jì)算程序，有1800種細(xì)菌的基因組裝配已經(jīng)完成。不過(guò)此前的方法即繁復(fù)耗時(shí)又很昂貴，對(duì)快速經(jīng)濟(jì)的新基因組裝配方法的需求依然很大。為此，博德研究所開(kāi)發(fā)了應(yīng)用特殊算法的ALLPATHS-LG軟件，對(duì)shotgun全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行裝配。該方法結(jié)合了Illumina和Pacific Biosciences測(cè)序儀各自的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，將其生成的三種數(shù)據(jù)類型進(jìn)行了混合。這些數(shù)據(jù)具有互補(bǔ)性，在理論上具有裝配整個(gè)基因組的能力。并且這一方法和數(shù)據(jù)處理基本都是自動(dòng)化的，zui大程度的減少了時(shí)間和經(jīng)費(fèi)的消耗。該方法采用的數(shù)據(jù)是Illumina生成的短讀序片段、Pacific Biosciences生成的長(zhǎng)讀序和Illumina生成的jumping pairs數(shù)據(jù)。
這些數(shù)據(jù)可以互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，Illumina技術(shù)在測(cè)序時(shí)由于樣品制備環(huán)節(jié)的擴(kuò)增偏好會(huì)導(dǎo)致某些區(qū)域的覆蓋度不足或缺失，而Pacific Biosciences的單分子測(cè)序技術(shù)不需要進(jìn)行擴(kuò)增，可以很好的覆蓋上述區(qū)域。同時(shí)堿基讀取度高的Illumina數(shù)據(jù)也彌補(bǔ)了Pacific Biosciences數(shù)據(jù)的不足。研究中用于生成jumping pairs的片段大小范圍很廣，能夠覆蓋相當(dāng)長(zhǎng)的距離（5 kb以上），這樣做犧牲了一定的度。不過(guò)，Pacific Biosciences單分子測(cè)序的讀取對(duì)于中等距離很有效，彌補(bǔ)了這一缺陷。研究人員充分利用了三種數(shù)據(jù)的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合度、偏好性和分辨率開(kāi)發(fā)了新的裝配算法。他們首先將短讀序進(jìn)行校正，應(yīng)用度高的短讀序進(jìn)行裝配，隨后再用長(zhǎng)讀序和jumping pairs*其中的缺口。這一過(guò)程的算法被整合入ALLPATHS-LG軟件，輸入長(zhǎng)讀序數(shù)據(jù)后該模塊會(huì)自動(dòng)啟動(dòng)。這種方法產(chǎn)生的裝配能夠兼容位點(diǎn)模糊性local ambiguities，允許裝配的位點(diǎn)中存在兩種或兩種以上的可能。這種模糊性可能是測(cè)序的系統(tǒng)性誤差產(chǎn)生的，也有可能是由裝配難以區(qū)分的重復(fù)拷貝引起的，或者是因?yàn)镈NA樣本中確實(shí)存在混合性位點(diǎn)。原核生物在培養(yǎng)過(guò)程中的突變，以及真核細(xì)胞基因組中的等位基因多態(tài)性都可能造成這一現(xiàn)象。研究人員應(yīng)用這一新方法，對(duì)16種細(xì)菌樣本進(jìn)行了基因組裝配，其中有三種細(xì)菌的基因組是已完成的，可作為研究的參照序列。作為參考序列的三種細(xì)菌分別是大腸桿菌E. coli、肺炎鏈球菌S. pneumoniae和類球紅細(xì)菌R. sphaeroides。這些菌種基因組的GC含量范圍很廣，從27%到69%，可以反映不同GC含量下裝配策略的有效性。研究人員發(fā)現(xiàn)裝配的結(jié)果與參照序列存在差異，要正確評(píng)價(jià)裝配的質(zhì)量就必須解讀這些差異。在早前發(fā)表的文章中，研究人員曾對(duì)E. coli參照序列進(jìn)行了6處校正，對(duì)R.sphaeroides參照序列進(jìn)行了374處校正。在本研究中，研究人員通過(guò)PCR、Sanger測(cè)序等方法進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步校正了參照序列，其中E. coli校正1處，R. sphaeroides校正32處。
研究人員還獲取了生成S. pneumoniae參照序列的原始讀序數(shù)據(jù)，使他們得以對(duì)參照序列的原始測(cè)序數(shù)據(jù)和新讀序數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合性的差異分析，當(dāng)然這種差異也可能是由兩個(gè)樣品真實(shí)序列的不同所引起的。因?yàn)闊o(wú)法得到生成參考序列的原始DNA樣本，研究人員還不能*解釋這種差異，不過(guò)他們?cè)u(píng)估了參考序列的錯(cuò)誤率。S. pneumoniae參考序列和新數(shù)據(jù)中存在63處差異，研究人員經(jīng)過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其中60處都是新方法的檢出正確。其余的三處，新舊兩種結(jié)果都可以說(shuō)是正確的，這可能是樣品自身帶來(lái)的差異。利用新方法， E. coli參考基因組的裝配生成了一個(gè)環(huán)形重疊群contig，基本確定了所有堿基（除一個(gè)堿基以外）。R. sphaeroides基因組裝配成兩個(gè)染色體，五個(gè)質(zhì)粒，形成11個(gè)重疊群。而S. pneumoniae的基因組裝配也形成了一個(gè)環(huán)形重疊群，其中存在6個(gè)模糊微點(diǎn)，沒(méi)有錯(cuò)誤。這樣的裝配結(jié)果非常，首先三種參照樣本的基因組裝配結(jié)果都沒(méi)有缺口，其次形成的重疊群都是基本完整的染色體（或質(zhì)粒），此外裝配結(jié)果的總體度比參考序列高。
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