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細胞爬片制備詳細過程

閱讀：117發(fā)布時間：2015-10-21

【爬片的準備】

1.爬片可用一般的蓋玻片，也可用爬片；

 

2.應用蓋玻片，可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪時可用前護士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開了。

 

如果接種大皿的話，我一般不將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養(yǎng)皿中，到染色時再將之切開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標的染色。

 

3.將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍（個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進行高壓消毒。

 

4.高壓后取出放入烤箱中烤干，備用?？靖珊罂煞湃氤瑑襞_中。

 

5.關于多聚賴氨酸，很多人都將玻片用此處理，以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細胞貼壁仍然很好，且在做后續(xù)的免疫細胞化學染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。

 

 

 

【細胞爬片】

 

1.*消化細胞后計數(shù)重懸細胞于*培養(yǎng)基中。

 

2.加細胞時，根據(jù)玻片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作。

 

3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入培養(yǎng)板內即可

 

4.待細胞貼壁后，可去上清加含藥培養(yǎng)基。

 

5.按照實驗設計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養(yǎng)皿底結合較緊，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數(shù)量的爬片取出時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。

 

 

 

 

 

 

【細胞爬片的固定】

 

細胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當然，根據(jù)研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會脫落。

 

另外在保存細胞爬片的時候，我一般用培養(yǎng)皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實驗時取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。

 

以下為常用的固定液

 

1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。

將純的丙酮預先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體的）細胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發(fā)）固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

 

2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 

主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等

室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

 

3. 95％乙醇，可用于免疫組化。

優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存較好。

缺點：但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度

室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

 

4. 甲醛(福爾馬林)應用zui廣 

優(yōu)點：形態(tài)結構保存好，且穿透性強，

缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結構可能部分或*掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。


產(chǎn)品：

CAS:33564-31-7,醋酸雙氟拉松現(xiàn)貨供應醋酸雙氟拉松33564-31-7
CAS:119356-77-3,達泊西汀現(xiàn)貨供應達泊西汀119356-77-3
CAS:147526-32-7,*現(xiàn)貨供應*147526-32-7
CAS:1404-93-9,鹽酸*現(xiàn)貨供應鹽酸*1404-93-9
CAS:274901-16-5,維他列汀現(xiàn)貨供應維他列汀274901-16-5
CAS:804-30-8,*現(xiàn)貨供應*804-30-8
CAS:53-43-0,去氫表雄酮現(xiàn)貨供應去氫表雄酮53-43-0
CAS:147489-06-3,(3R,5S,6E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉-基]-2,2-二甲基-1,3-二氧六環(huán)-6-庚烯酸叔丁酯現(xiàn)貨供應(3R,5S,6E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉-基]-2,2-二甲基-1,3-二氧六環(huán)-6-庚烯酸叔丁酯147489-06-3
CAS:231277-92-2,拉帕替尼現(xiàn)貨供應拉帕替尼231277-92-2
CAS:55486-09-4,5-甲基-2'-甲氧基-尿苷現(xiàn)貨供應5-甲基-2'-甲氧基-尿苷55486-09-4
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CAS:611-53-0,5-碘-2'-脫氧胞苷現(xiàn)貨供應5-碘-2'-脫氧胞苷611-53-0
CAS:2137-18-0,孕諾酮 Gestonorone現(xiàn)貨供應孕諾酮 Gestonorone2137-18-0
CAS:148849-67-6,鹽酸伊伐布雷定現(xiàn)貨供應鹽酸伊伐布雷定148849-67-6
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CAS:521-12-0,屈他雄酮丙酸酯現(xiàn)貨供應屈他雄酮丙酸酯521-12-0
CAS:84379-13-5,溴他西尼現(xiàn)貨供應溴他西尼84379-13-5
CAS:1778-02-5,孕烯醇酮醋酸酯現(xiàn)貨供應孕烯醇酮醋酸酯1778-02-5
CAS:471-53-4,甘草次酸現(xiàn)貨供應甘草次酸471-53-4
CAS:1961-12-1,鹽酸辛因現(xiàn)貨供應鹽酸辛1961-12-1
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CAS:110119-84-1,Donepezil HCL現(xiàn)貨供應Donepezil HCL110119-84-1
CAS:3416-24-8,D-氨基葡萄糖 Glucosamine現(xiàn)貨供應D-氨基葡萄糖 Glucosamine3416-24-8
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