一、原代培養(yǎng)及其操作步驟
原代分離細(xì)胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后，經(jīng)機(jī)械以及消化分離成單個(gè)細(xì)胞或單一型細(xì)胞群，使之在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定的營養(yǎng)條件下，生存、生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)細(xì)胞常有不同的細(xì)胞成分，生長(zhǎng)緩慢，但是更能代表所來源的組織細(xì)胞類型和表達(dá)組織的特異性特征。利用原代細(xì)胞培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn)，如藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗(yàn)效果很好。其操作步驟如下。
1. 剪切組織 先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用*去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后，用*將組織切成若干小塊，移入*小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪，反復(fù)剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm3大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗一次。
2. 消化分離 消化分離的目的是將細(xì)小的組織塊消化分離成細(xì)胞團(tuán)或分散的單個(gè)細(xì)胞，以利于進(jìn)一步的培養(yǎng)，常用的消化酶有*和膠原酶。
3. 培養(yǎng) 細(xì)胞懸液用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為（2～5）×105 cells／ml，或?qū)嶒?yàn)所需密度，分裝于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞懸液的量以覆蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜。置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5％CO2，37℃靜置培養(yǎng)。一般3～5d，原代培養(yǎng)細(xì)胞可以黏附于瓶壁，并伸展開始生長(zhǎng)，可補(bǔ)加原培養(yǎng)液量1／2的新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后換液，一般7～14d可以長(zhǎng)滿瓶壁，進(jìn)行傳代。
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