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技術(shù)文章

多肽合成知識介紹

閱讀:598發(fā)布時間:2017-8-8

1.多肽合成的基本原理  
  多肽固相合成法是多肽合成化學的一個重大的突破。它的zui大特點是不必純化中間產(chǎn)物,合成過程可以連續(xù)進行,從而為多肽合成的自動化奠定了基礎。目前全自動多肽的合成,基本都是固相合成。基本過程如下: 
  基于Fmoc化學合成,先將所要合成的目標多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連,然后以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點,同期它的氨基酸的羧基(已經(jīng)活化)作用形成肽鍵,不斷重復這一過程,即可得到目標多肽。根據(jù)多肽的氨基酸組成不同,多肽后處理方式不同,純化方式也有差異。 

2.關(guān)于Antigen Grade 多肽必須在在多肽的一端增加 Cysteine嗎? 

答:不一定,偶連的方式與偶連的活化劑和氨基酸組成有關(guān)。EDC: 通過C端 COOH連接,一般要求序列中無Glu (E), Asp (D),或an amidated C-terminus;Act. EDC Method: 通過 N端的氨基偶連,要求序列中無Lys (K) 或N端沒有被乙?;?;MBS:通過Cys的基團載體中其他 SH連接形成 S-S. 如果序列中無 Cys,就需要添加Cys基團,增加在N端。 

3.制備多肽抗體,常用的載體有那些?如何選擇?
答:多肽分子量很小,免疫應答效果差,需要與載體偶連以提高免疫源性。載體大多數(shù)為高分量的蛋白質(zhì),常用的載體有KLH (銅藍蛋白),BSA, OVA等。KLH為。 ELISA測定多肽抗體效價時,有些多肽直接包板有困難,需要與BSA等偶連后再包板。

4.做免疫用的多肽多長為合適?答:10-15個氨基酸,當然長一些免疫效果好一些,不過合成費用會上去。10aa以下的多肽免疫效果比較差。

5.為什么多肽抗體有時不能用于Western Blot?  
答:這比較常見,Elisa一般都沒有什么問題。 

6.免疫用多肽的純度要很高嗎?  
答:純度高當然好,但是代價也高。問題是如果純度為90-95%的多肽能產(chǎn)生抗體,65-75%純度的多肽,一般也不對失敗。 

7.我們合成的多肽溶解性如何? 
答:很難準確預測一個多肽的溶解性及合適的溶劑是什么。如果多肽難以溶解就認為多肽合成有問題就大錯特錯了。那么如何判斷多肽的溶解性?  
  
8.多肽狀態(tài)如何?如何保存儲存?  
答:我們提供的多肽是粉末狀,一般為灰白色,組成不同,多肽粉末的顏色有差異。多肽一般需要避光保存。長期保存應保存在-20度,短期可以保存在4度??梢远虝r間室溫運輸。 

9.多肽的量是怎么確定?
答:一般用天平直接稱重。 


10.如何溶解多肽?
答:溶解多肽是非常頭痛的事情,一般很難一下子確定合適的溶劑。通常是先取一點試一試,在沒有確定合適的溶劑前千萬不要全部溶解。 
  下列方法有助于您選擇合適的溶劑。  
(1)判定多肽的電荷特定,設定酸性氨基酸Asp (D), Glu(E)和C端COOH為-1;堿性氨基酸Lys(K),Arg(R), His (H)及N端NH2為+1,其他氨基酸的電荷為0。計算出凈電荷數(shù)。  
(2)如果凈電荷數(shù)>0,多肽為堿性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸(10%以上);如果多肽還不能溶解,加入少量 TFA(25ul)溶解,然后加入500ul水稀釋
(3)如果凈電荷數(shù)<0,多肽為酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水(25ul)溶解,然后加入500ul水稀釋。   
(4) 如果凈電荷數(shù)=0,多肽為中性,一般需要用有機溶劑如乙腈,甲醇或異丙醇,DMSO等溶解。還有人建議需要假如尿素等溶解疏水性很大的多肽。   

11.不同純度級別多肽的使用領域是什么?   
答:不同純度級別多肽的使用領域并不相同。  
(1) 粗品和脫鹽級別的純度和多肽的長度有關(guān),F(xiàn)moc固相多肽合成每個氨基酸的偶   連效率在95%以上,下表列出了每步合成的產(chǎn)率,可以幫助您判定粗品和脫鹽級 別是否適合您的用途,從而節(jié)省開支。 
長度 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13  
合成效率> % 95 90 85 81 77 73 69 66 62 59 56 53   
長度 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25  
合成效率> % 50 48 45 43 41 40 37 35 37 35 33 32  
  
(2)多肽合成有一個重要的用途是用來免疫抗體,一般情況下免疫級65-75%左右純 度的多肽就達到免疫的要求。如果純度為90-95%的多肽能產(chǎn)生抗體,65-75%純     度的多肽,一般也不會失敗。純度高當然好,但是代價高時間也相對較長。Elias   測定抗體效價時,同樣70%左右的純度就可以滿足。 
(3)研究級80%以上純度的多肽可以用于酶底物定性研究、體外生物活性分析,免   疫封閉、磷酸化研究、親和層析,單抗制備等研究  
(4)90%以上的純度可以用于包括細胞體內(nèi)外活性分析,定量分析等大多數(shù)研究。   NMR研究的純度需要達到95%以上。  

12. 非HPLC純化的多肽中有那些雜質(zhì)?  
答:粗品和脫鹽級別的多肽中多肽和非多肽類雜質(zhì):如非全長肽和多肽后處理的一     些原料如DTT、TFA等。  
U  
13. HPLC純化的多肽有那些雜質(zhì)?   
答: 經(jīng)過HPLC純化的多肽,即使是簡單的純化,其中的雜質(zhì)主要是短肽和微量   
  
14.多長的多肽為合適?  
答:根據(jù)多肽合成需要多肽的長度,電荷,親疏水性等因素。長度越長,合成粗品的純度和產(chǎn)率都隨著降低,純化的難度和無法合成的幾率就會大些。當然多肽功能區(qū)的序列是無法改變的,但是為了多肽的順利合成,有時不得不在功能取的上下游增加一些輔助氨基酸,以改善多肽的溶解性和親疏水性。如果多肽太短,合成也可能有問題,主要問題是合成的多肽在后處理過程中有一定的難度,5肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否則后處理難度加大。15個氨基酸殘基以下的多肽一般都可以得到滿意的產(chǎn)率和得率。  

15.如何從多肽序列中判定多肽的溶解性?  
(1)     多肽中如果含有高比例的疏水性很強的氨基酸如Leu, Val, Ile, Met, Phe 和 Trp,多肽很難溶解與水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無論是純化或合成,都有可能有問題。   
(2)     一般情況下疏水性氨基酸的比例<50%, 不能連續(xù)5個連續(xù)aa為疏水性,帶電荷的氨基酸的(正電荷K, R, H, N-terminus,負電荷 D, E, C-terminus)的比例達到20%,在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸,也可以改善溶解性。 ]  
  
16.為什么含有Cys, Met, 或 Trp的多肽難合成?  
答:含有Cys, Met, 或 Trp的多肽難以合成,同時難以獲得高純度的產(chǎn)品。主要因為這些基團不穩(wěn)定,易氧化。這些多肽的使用和儲存都需要特別注意,避免反復開啟蓋子。   

17.為什么有些多肽的合成產(chǎn)率或純度會比較低?  
答:多肽合成與引物合成有比較大的區(qū)別,不能的引物合成很少,但是不能合成的多肽經(jīng)常有。如Val, Ile, Tyr, Phe, Trp, Leu, Gln, 和Thr這些氨基酸比鄰或重復時,多肽鏈在合成過程中不能*舒展溶解,合成效率下降。下列幾種情形,合成效率和產(chǎn)物的純度都比較低:重復 PRO,Ser-Ser, 重復Asp, 4個連續(xù) Gly等。   
  
18.多肽是如何純化的?  
答:多肽純化一般使用反相柱(如C8, C18等),214nm。制備多肽時可以根據(jù)需要使用制備和半制備柱。緩沖體系通常為含TFA的溶劑,pH2. Buffer A為0.1% TFA 去離子水配制,Buffer B為.1% TFA /ACN /pH 2。純化前用Buffer A溶解;如果溶解不好,用buffer B溶解后,然后用Buffer A稀釋;對疏水性強的多肽,有時還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。 HPLC分析多肽粗品,如果多肽不長(1a以下),一般有主峰,主峰通常為全長產(chǎn)物;對于20 aa以上的長肽,如果沒有主峰,HPLC和MS必須結(jié)合起來,判定分子量,從而確定哪個峰是目標多肽。 
  
19.含 Cys的多肽如何處理?   
答:含Cys 的多肽比較容易氧化。多肽純化過程中一般都是在pH2的酸性條件性完成的,這種條件下Cys 的SH,基本保持還原狀態(tài),不需要特殊的后處理。當然含 Cys的多肽會慢慢的氧化,氧化的速度取決于保存條件和序列組成。如果是需要 cys形成S-S,純化一般需要在堿性或中性條件下純化。


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