中心法則是遺傳信息從DNA到DNA的復(fù)制、繼而從DNA傳遞給RNA的轉(zhuǎn)錄、再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)的翻譯過程的轉(zhuǎn)移法則，是生物大分子DNA、RNA和蛋白質(zhì)參與細(xì)胞生命活動所遵循的重要規(guī)律。其中DNA復(fù)制就是這一法則的*步，也是zui重要的一步，雖然多年來科學(xué)家們解析了這一步驟的多個方面，但是關(guān)于復(fù)制起始復(fù)合體（ORC）的環(huán)狀蛋白質(zhì)依然是個謎。
來自美國文安德爾研究所等處的研究人員zui近詳細(xì)描述了DNA復(fù)制中的這個關(guān)鍵*步，相關(guān)研究成果公布在2月13日的Nature Structural & Molecular Biology雜志上，文章的通訊作者之一，文安德爾研究所的表觀遺傳學(xué)中心教授李慧林（Huilin Li，音譯）博士說，“這是關(guān)于一個‘*’環(huán)的故事。生物學(xué)家多年前就已經(jīng)知道，ORC和解旋酶是DNA復(fù)制起始和復(fù)制進(jìn)程中*的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但到目前為止，我們從未了解ORC環(huán)如何將解旋酶環(huán)裝載到DNA上的。”
多細(xì)胞生物在細(xì)胞分裂之時進(jìn)行生長，在細(xì)胞分裂之前，它必須為新細(xì)胞生成組成元件副本。由于DNA信息被密封在DNA雙鏈內(nèi)部，訪問和復(fù)制信息之前一種叫做復(fù)制體（replisome）的專門機器必須要解開DNA鏈。MCM馬達(dá)是復(fù)制體的關(guān)鍵組成部分，它負(fù)責(zé)解開配對的DNA鏈。而MCM是一個閉合的蛋白質(zhì)環(huán)，在它環(huán)繞DNA長鏈之前必須首先要打開它，ORC就負(fù)責(zé)解決這一問題。它可以打開MCM環(huán)，讓其能夠環(huán)繞并解開DNA。
這項研究揭示了ORC的特殊α-螺旋能進(jìn)入DNA的一個凹槽中，啟動DNA復(fù)制的一系列級聯(lián)微管相互作用。此外研究還發(fā)現(xiàn)ORC在Cdc6和Cdt1的幫助下，通過翼狀螺旋結(jié)構(gòu)域的配對相互作用將解旋酶核心部分加載到DNA上，這樣就會形成14個組合蛋白結(jié)構(gòu)，完成*個解旋酶環(huán)的加載，然后準(zhǔn)備加載下一個環(huán)。
這整個過程代表了一個非常復(fù)雜且精細(xì)的系統(tǒng)開始運作，在人體許多細(xì)胞中DNA上的數(shù)萬個位點上不間斷工作，它們都是從ORC開始的。
此前的研究表明，ORC是一個六亞基蛋白質(zhì)復(fù)合體，其中有五個亞基形成了一個微微張開的環(huán)，第六個亞基Orc6形成了一條尾巴。研究顯示，亞基組成的復(fù)合物形成月牙狀，包裹住DNA雙鏈。然后ORC會召集第七種蛋白，也就是Cdc6，繞住DNA。這個環(huán)與第二個環(huán)相連，微染色體維持蛋白（Cdt1-bound Mcm2-7 hexamer）圍繞在DNA周圍，完成*個Mcm2-7六聚體的加載。
“這就像是把一條珍珠串在一根繩子上，不過DNA鏈更長，因此珍珠不會到達(dá)末端。相反它們會沿著鏈以某種方式打開，之后再次關(guān)閉，”文章的另外一位通訊作者，倫敦帝國理工學(xué)院教授Christian Speck說。
這項研究是通過冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）完成，李教授表示，“我們希望通過描繪這一過程，能zui終將這種知識轉(zhuǎn)化為DNA復(fù)制相關(guān)的治療方法，用于包括癌癥和罕見病在內(nèi)的多種疾病的治療”。
復(fù)制起始復(fù)合體（ORC）是DNA復(fù)制的關(guān)鍵元件，這項研究主要是采用了什么方法剖析了ORC環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一系列組裝過程呢？
李教授：我們采用了cryo-EM方法分析了釀酒酵母OCCM（ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7）復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，這個復(fù)合物是由ORC-Cdc6通過Cdt1結(jié)合的Mcm2-7六聚體捕獲結(jié)合而形成的。我們利用體外反應(yīng)方法獲得了復(fù)合物：在帶有復(fù)制起始質(zhì)粒DNA的試管中將純化組分如ORC，Cdc6，Cdt1和解旋核心復(fù)合物Mcm2-7混合在一起。DNA會連接到磁珠上，然后利用磁性將反應(yīng)產(chǎn)物——OCCM復(fù)合物與反應(yīng)物分離。
這是一項合作成果，我們文安德爾研究所的實驗室完成了冷凍電子顯微的結(jié)構(gòu)測定，而樣本是由倫敦帝國學(xué)院的Christian Speck博士實驗室準(zhǔn)備的。參與這項工作的還包括冷泉港實驗室的Bruce Stillman博士實驗室，他們完成了一些生物化學(xué)研究，另外交聯(lián)質(zhì)譜的工作則由愛丁堡大學(xué)的Juri Rappsilber博士實驗室完成。
研究發(fā)現(xiàn)了ORC、Cdc6等組成的14個蛋白組合體結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)的特點是什么？相比于之前發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)具有哪些相同之處和不同之處呢？
李教授：這項工作zui重要的發(fā)現(xiàn)是揭示了Mcm2-7如何通過ORC-Cdc6加載到原始DNA上的。整個裝載過程是由裝載機（ORC-Cdc6）和Mcm2-7中都發(fā)現(xiàn)的所謂翼型螺旋結(jié)構(gòu)域（WHD）介導(dǎo)的。ORC-Cdc6中的幾個WHD結(jié)構(gòu)在裝載過程中是與Mcm2-7的WHD相互鎖定的。
我們還以近原子的分辨率獲得了與起始DNA結(jié)合的ORC-Cdc6的結(jié)構(gòu)，這是OCCM結(jié)構(gòu)的一部分。一直以來科學(xué)家們都知道酵母ORC具有識別復(fù)制起點某些特殊序列的能力，但ORC如何做到這一點依然是個謎。我們的結(jié)構(gòu)揭示出ORC的一個亞基Orc4具有特殊的插入α-螺旋，這種螺旋可以滑入DNA雙鏈的主槽中，從而令ORC原始序列具有識別能力。在ORC-Cdc6召集Mcm2-7的時候，它處于激活狀態(tài)。另外一個實驗室曾于Nature發(fā)表了fly ORC（2015）的晶體結(jié)構(gòu)，那個結(jié)構(gòu)處于非激活狀態(tài)，因為fly ORC既不能與結(jié)合DNA兼容，也不能與負(fù)載因子Cdc6兼容。
zui近，冷泉港實驗室的Leemor Joshua-Tor實驗室在eLife（2017）與我們合作發(fā)布了人類的ORC結(jié)構(gòu)。我們的酵母ORC結(jié)構(gòu)與人類ORC結(jié)構(gòu)非常相似。
此外，我們的這項研究還揭開了Cdt1的神秘面紗，Cdt1是一種負(fù)載因子，但它在加載過程中的作用一直是一個謎。我們驚訝的發(fā)現(xiàn)Cdt1能形成了一個三結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，并且支撐三個Mcm亞基：Mcm2，Mcm4和Mcm6。有趣的是，其中一個Cdt1結(jié)構(gòu)域向上，能清除與ORC-Cdc6相互作用的Mcm2-7的末端。因此我們認(rèn)為Cdt1能幫助準(zhǔn)備Mcm2-7，其準(zhǔn)備好與ORC-Cdc6的加載。
此外，能給我們介紹一下您的研究組嗎？比如主要的研究方向，近期的研究成果等等。
李教授：多年來，我都在紐約州立大學(xué)石溪分校，以及布魯克海文國家實驗室工作，去年8月我將我的實驗室搬到了文安德爾研究所。我的研究重要的一環(huán)就是低溫儀器，文安德爾研究所是一家私人生物醫(yī)學(xué)研究機構(gòu)，zui近剛建立了低溫冷凍電鏡設(shè)施。
我們實驗室致力于真核生物中的DNA復(fù)制研究，我們還與其他DNA復(fù)制生物學(xué)家合作，研究復(fù)制叉上的解旋酶功能。關(guān)于這個內(nèi)容，我們zui近也發(fā)表了一篇PNAS文章（2017年1月）。
