隨著熒光檢測的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測方法從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到多重?zé)晒?。這一趨勢背后有多個推動力。zui重要的是，熒光檢測能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時檢測幾個目標(biāo)蛋白，而不再需要剝離和重新雜交。熒光的其他好處在于動態(tài)范圍更寬、信號穩(wěn)定性更好。
熒光blotting的小貼士
• 抗體濃度應(yīng)當(dāng)優(yōu)化，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比zui高的稀釋度。
• 從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到熒光檢測時，一抗?jié)舛葢?yīng)當(dāng)增加；通常來說是增加2-5倍。二抗?jié)舛瓤赡芤残枰獌?yōu)化；1:5,000稀釋是個不錯的起點(diǎn)。在使用特定抗體時，可以參照生產(chǎn)商的建議。
• 為了讓信噪比zui高，應(yīng)使用自發(fā)熒光低的膜，如 Immun-Blot® low fluorescence （LF） PVDF membrane。
• 許多封閉液都成功用于熒光檢測。我們建議使用0.5-5% 酪蛋白、zui多5%的脫脂奶粉，或zui多3% BSA，溶于TTBS中。
• 緩沖液中的顆粒可能停留在膜上，并造成熒光假象。只使用高質(zhì)量的試劑，并對所有緩沖液過濾滅菌。
• 使用鈍的鑷子從邊緣操作。避免劃破膜或弄皺，這會在熒光檢測時造成假象。
• 使用鉛筆來標(biāo)記膜，因為許多墨水都會發(fā)出熒光。
• 溴酚藍(lán)會發(fā)出熒光。確保染料與樣品已分開，切掉凝膠上包含染料的部分，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍(lán)。
• 無需在暗處開展免疫檢測；正常的室內(nèi)燈光不會使熒光標(biāo)記的抗體發(fā)生光漂白。不過，熒光標(biāo)記抗體的儲液應(yīng)保存在暗處。
• 在處理膜時，使用無粉末的手套，以避免膜上出現(xiàn)假象或指紋。
多重分析的小貼士
• 使用來自不同宿主的一抗（如小鼠和兔）。兩個親緣關(guān)系相近物種的抗體（如大鼠和小鼠）通常會造成交叉反應(yīng)，即使抗體已經(jīng)過交叉吸附。
• 使用經(jīng)過交叉吸附的二抗，以避免交叉反應(yīng)。
• 使用光譜上不同的熒光基團(tuán)偶聯(lián)物，避免交叉通道熒光。
• 在同時檢測多個目標(biāo)之前，單獨(dú)優(yōu)化每個目標(biāo)的檢測。由于一些一抗并非很特異，在膜上會產(chǎn)生多條帶，故多重實(shí)驗之前的單目標(biāo)檢測將有助于確定每個抗體的條帶模式。
• 大部分膜在波長較短的激發(fā)光下會顯示出較高的背景。記住，在藍(lán)色通道檢測zui強(qiáng)的目標(biāo)，在綠色通道檢測中等目標(biāo)，而保留紅色通道來檢測zui弱的目標(biāo)。
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