用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求:純度高,催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高,專一性強(qiáng),性質(zhì)穩(wěn)定,來源豐富,價格不貴,制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外,它的相應(yīng)底物易于制備和保存,價格低廉,有色產(chǎn)物易于測定等。
在ELISA中,常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中,應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白,含糖量約為18%,分子量為44000,是一種復(fù)合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結(jié)合而成,是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有zui高吸收峰,輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl,德文,意為純度數(shù))表示,是403nm的吸光度與280nm吸光度之比,高純度的HRP的RZ≥9.0。
HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外,更有價格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點。值得注意的是,在選用酶制劑時,除其純度RZ外,更應(yīng)注意酶的活力。高純度的酶如保存不當(dāng),活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示,可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進(jìn)行試驗。
國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個來源,分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同,從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000,酶作用的pH為8.0;用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000,zui適pH為9.6。在ELISA中,AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng),空白值也較低,但AP價格昂貴,制備結(jié)合物所得率也較HRP低。
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