CIK細(xì)胞細(xì)胞制備方法詳解
【細(xì)胞制備】
1．外周血單個核細(xì)胞的采集
1.1用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個核細(xì)胞50-100mL；
1.2淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個核細(xì)胞（PBMC）；
1.3無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。
2．CIK細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
2.1將PBMC按1-2 x 106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000 U/ml 的重組人IFN-g，37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
2.224h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細(xì)胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1a。
2.3每3天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml；
2.4在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK細(xì)胞。
2.5CIK細(xì)胞質(zhì)控：
2.9.1臺盼藍(lán)染色檢測：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；
2.9.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì)胞的比例應(yīng)在20%以上。
2.9.3細(xì)胞殺傷實驗：以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞（可為原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株）為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10 : 1（數(shù)目比） 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細(xì)胞1 x 104個，終體積為200 ml，設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶（LDH） 試劑盒檢測效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率。
2.9.4收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素（標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu）。
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