預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中OT/BGP含量。
說(shuō)明
1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。
2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。
4．剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
實(shí)驗(yàn)原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗OT/BGP抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、*化的抗OT/BGP抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的OT/BGP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4. *標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. *標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
本的采集及保存
1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
標(biāo)本的稀釋原則：
首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl*標(biāo)記抗體加99μl*標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同*標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
注意事項(xiàng)
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請(qǐng)避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
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