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技術(shù)文章

ELISA的概念、原理、操作步驟

閱讀:522發(fā)布時間:2011-7-8

ELISA的概念、原理、操作步驟

  ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。  
 原理
  ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,每加入一種試劑孵育后,可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中,通過不同的設(shè)計,具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。  
 操作步驟
    
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110μgml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。簡稱洗滌,下同
  2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37孵育1小時。然后洗滌。同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔
  3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml37孵育0.51小時,洗滌。
  4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,371030分鐘。
  5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
  6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。
  方法二 用于檢測未知抗體的間接法:   
1
、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110μgml,每孔加0.1ml,4過夜。
2、次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,37孵育1小時,洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體抗抗體)0.1ml37孵育30-60分鐘,洗滌,zui后一遍用DDW(超純水)洗滌。其余步驟同雙抗體夾心法4、5、6。
3. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml371030分鐘。
4.
 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml
5.
 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

 試劑器材
  1. 試劑
  (1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):
    NaCO31.59 NaHCO3  2.93  加蒸餾水至1000ml  
    (2)
 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)0.15M KH2PO4 0.2 Na2HPO4·12H2O 2.9 NaCl  8.0KCl 0.2 Tween-20 0.05 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
  (3) 稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成510%使用。
  (4) 終止液(2M H2SO4):蒸餾水178.3ml,逐滴加入濃硫酸(98)21.7ml。
  (5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4/L) 25.7ml 0.1M檸檬酸(19.2/L) 24.3ml 加蒸餾水50ml。
  (6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺使用液:TMB(10mg5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩沖液(PH5.5) 10ml0.75H2O2 32μl
  (7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液(PH5.5) 1ml 3H2O2 2μl
  (8) 抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。
  (9) 正常人血清和陽性對照血清。
  2. 器材:
  (1) 聚苯乙烯塑料板簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔,ELISA檢測儀,50μl100μl加樣器,塑料滴頭,小毛巾,洗滌瓶。
  (2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
  (3) 4冰箱,37孵育箱。
 注意事項
  1. 正式試驗時,應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
  2. 在ELISA中,進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:
  (1) 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
  (2) 包被抗體或抗原的選擇:將抗體或抗原吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH9.09.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用41824小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.010μgml進(jìn)行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為110μgml
  (3) 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定見酶標(biāo)記抗體部份。然后再固定其它條件或采取方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
  (4) 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體OPD有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMBABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。
ELISA相關(guān)儀器試劑設(shè)備
·                                 酶標(biāo)儀
·                                 洗板機(jī)
·                                 化學(xué)發(fā)光檢測儀
·                                 ELISA檢測試劑盒
·                                 ELISPOT檢測
·                                 ELISA試劑盒
·                                 抗體
·                                 酶標(biāo)板
 

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