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技術(shù)文章

人骨鈣素ELISA試劑盒使用說明書

閱讀:573發(fā)布時(shí)間:2011-7-20

 

人骨鈣素ELISA試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 標(biāo)本:血清或血漿 
 
試驗(yàn)原理
       OT試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA.已知OT濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將OT和*標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中OT的濃度呈比例關(guān)系。
 
試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份
96孔配置
48孔配置
96/48人份酶標(biāo)板
1塊板(96T
半塊板(48T
塑料膜板蓋
1
半塊
標(biāo)準(zhǔn)品:100ng/ml   
1瓶(1.0ml
1瓶(0.5ml
空白對(duì)照
1瓶(1.0ml
1瓶(0.5ml
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液
1瓶(8.0ml
1瓶(4.0ml
*標(biāo)記的抗OT抗體
1瓶(8.0ml
1瓶(4.0ml
親和鏈酶素-HRP
1瓶(12ml
1瓶(5ml
洗滌緩沖液
1瓶(20ml
1瓶(10ml
底物A
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
底物B
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
終止液
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
 
自備材料
1. 蒸餾水。
2. 加樣器:5ul、10ul、50ul100ul、200ul500ul、1000ul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
 
樣品收集、處理及保存方法
 
1、血清……操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
 
2、 血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3 細(xì)胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4 組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液。
 5、 保存……如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測(cè)前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
 
人骨鈣素ELISA試劑盒操作注意事項(xiàng)
 
●   試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。
●   實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
●   不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
●   使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時(shí),避免使用帶金屬部分的加樣器。
●   使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
●   底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感,避免長時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
●   加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
●   按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
 安全性 
1.   避免直接接觸終止液和底物A、B,一旦接觸到這些液體,請(qǐng)盡快用水沖洗。
2.   實(shí)難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3.   不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。 
試劑的準(zhǔn)備
 
1.   標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行:
100
ng/ml
(6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
50
ng/ml
(5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25
ng/ml
(4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
12.5
ng/ml
(3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
6.25
ng/ml
(2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
3.12
ng/ml
(1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0
ng/ml
(空白對(duì)照)
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
2.   洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。 
試劑盒性能
 1.   靈敏度:zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990
2.   特異性:不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3.   重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。 
1.   使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2.   根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3.   加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的*標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37溫育45分鐘。
4.   甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5.   每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6.   甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7.   每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育5分鐘。避免光照。
8.   取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9.   450nm波長處測(cè)定各孔的OD值。 
結(jié) 果 判 斷 與 分 析 
1、 儀器值:于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD
2、 以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的OT標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的OT含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
3、 檢測(cè)值范圍: 0-100ng/ml
4、 敏感度:0.39ng/ml


 

 

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