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技術(shù)文章

人(Human) 免疫球蛋白G (IgG) ELISA檢測試劑盒

閱讀:384發(fā)布時間:2011-10-8

 

(Human) 免疫球蛋白(IgG) ELISA檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用     標(biāo)本:血清或血漿
 
試驗原理
IgG試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA.已知IgG濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將IgG和*標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中IgG的濃度呈比例關(guān)系。
 
試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份(2-8保存)
96孔配置
48孔配置
配制
96/48人份酶標(biāo)板
1塊板(96T
半塊板(48T
即用型
塑料膜板蓋
1
半塊
即用型
標(biāo)準(zhǔn)品:80g/L
1瓶(0.6ml
1瓶(0.3ml
按說明書進(jìn)行稀稀
空白對照
1瓶(1.0ml
1瓶(0.5ml
即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液
1瓶(5ml
1瓶(2.5ml
即用型
*標(biāo)記的抗IgG抗體
1瓶(6ml
1瓶(3.0ml
即用型
親和鏈酶素-HRP
1瓶(10ml
1瓶(5.0ml
即用型
洗滌緩沖液
1瓶(20ml
1瓶(10ml
按說明書進(jìn)行稀釋
底物A
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
即用型
底物B
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
即用型
終止液
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
即用型
標(biāo)本稀釋液
1瓶(12ml
1瓶(6.0ml
即用型



 
自備材料
1蒸餾水。
2加樣器:5ul、10ul50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3振蕩器及磁力攪拌器等。
 
安全性
1避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
2實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
 
操作注意事項
1試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。
2實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
3不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
5使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
 
樣品收集、處理及保存方法
1、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
5、保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
 
試劑的準(zhǔn)備
1標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備,不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行:

80 g/L
6號標(biāo)準(zhǔn)品)
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
40 g/L
5號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
20 g/L
4號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
10 g/L
3號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
5.0 g/L
2號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2.5 g/L
1號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 g/L
空白對照)
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。



 
2洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。
 
 
操作步驟
1使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液11稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的*標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37溫育1小時。
4甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37溫育30分鐘。
6甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7每孔加入底物A、B50ul,輕輕振蕩混勻,37溫育10分鐘。避免光照。
8取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9450nm波長處測定各孔的OD值。
 
建議使用的實驗方案

 
標(biāo)準(zhǔn)品濃度(g/L
 
A
80
80
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
 
B
40
40
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
 
C
20
20
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
 
D
10
10
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
 
E
5.0
5.0
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
 
F
2.5
2.5
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
 
G
0
0
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
 
H
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
 

局限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。
 
試劑盒性能
1.靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2.特異性:不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3.重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
 
結(jié) 果 判 斷與分析
1、儀器值:于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD
 
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y,相應(yīng)的IgG標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X,做得相應(yīng)的曲線,樣品的IgG含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
 
3、檢測值范圍:0-80g/L
 
4、敏感度:0.1 g/L
保存條件及有效期
1.試劑盒保存:;2-8
2.有效期:6個月
 

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