Elisa實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)
Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷
定量測(cè)定
ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線zui高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時(shí)常用半對(duì)數(shù)紙，以檢測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，*較呈直線的部分是的檢測(cè)區(qū)域。
定性測(cè)定
定性測(cè)定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出"有"或"無(wú)"的簡(jiǎn)單回答，分別用"陽(yáng)性"、"陰性"表示。"陽(yáng)性"表示該標(biāo)本在該測(cè)定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無(wú)反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來(lái)表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的zui高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。
在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類(lèi)反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。
（1） 間接法和夾心法
這類(lèi)反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性，顯色清晰者為陽(yáng)性。但在ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后常可出現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測(cè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類(lèi)似物（見(jiàn)3.6）。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽(yáng)性的指標(biāo)。
目視法簡(jiǎn)捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽(yáng)性對(duì)照（P）、和陰性對(duì)照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽(yáng)性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類(lèi)。
a．陽(yáng)性判定值
陽(yáng)性判定值（cut-off value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。
用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽(yáng)性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽(yáng)性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過(guò)對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測(cè)HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽(yáng)性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)（NCX）和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例0.400），試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX；如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算：
陽(yáng)性判定值=NCX+0.05
標(biāo)本A值＞陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性，小于陽(yáng)性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對(duì)各種試劑均可通用。
根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生"試驗(yàn)無(wú)效"的后果。
b.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值
在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值。也有寫(xiě)作P/N的，這里的P不代表陽(yáng)性（positive），而是病人（patient）的縮寫(xiě)，不應(yīng)誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測(cè)定所沿用。實(shí)際上每一測(cè)定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對(duì)照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對(duì)照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類(lèi)試劑盒規(guī)，如N<0.05（或其他數(shù)值），則按0.05計(jì)算，否則將出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
（2）競(jìng)爭(zhēng)法
在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競(jìng)爭(zhēng)抑制物的量，一般調(diào)節(jié)陰性對(duì)照的吸光度在1.0-1.5之間，此時(shí)反應(yīng)zui為敏感。
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S、P和N的吸光值。計(jì)算方法主要也有兩種，即陽(yáng)性判定值法和抑制率法。
a. 陽(yáng)性判定值法
與間接法和夾心法中的陽(yáng)性判定值法基本相同，但在計(jì)算公式中引入陽(yáng)性對(duì)照A值，現(xiàn)舉某種檢測(cè)抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿，陽(yáng)性對(duì)照中抗HBc含量為125±100u/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均值（NCX）和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)小于2.000，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算×NCX；如有2個(gè)陰性對(duì)照A超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算：
陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
標(biāo)本A值≤陽(yáng)性判定值的反應(yīng)為陽(yáng)性，A＞陽(yáng)性判定值的反應(yīng)為陰性。
b. 抑制率法
抑制率表示標(biāo)本在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合中標(biāo)本對(duì)陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計(jì)算：
抑制率（%）= （陰性對(duì)照A值-標(biāo)本A值）×100%/陰性對(duì)照A值
一般規(guī)定抑制率≥50%為陽(yáng)性，＜50%為陰性。
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