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技術(shù)文章

細(xì)胞活性有哪些測定方法

閱讀:449發(fā)布時間:2011-12-20

 

細(xì)胞活性測定方法
細(xì)胞活性測定方法有臺盼藍(lán)染色法、克?。洌┬纬煞?、3H放射性同位素?fù)饺敕ā?MTT法等。其中MTT法以其快速簡便,不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan 為水不溶性的,需要加有機溶劑溶解,由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan,故有時重復(fù)性略差。為了解決這個問題,研究人員又開發(fā)了很 多種水溶性的四氮唑鹽類:如XTT、CCK-8(WST-8)等。
現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹:
1.MTT
MTT:化學(xué)名: 3-(4,5-二甲基噻唑,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名:噻唑藍(lán)。檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲 ,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。
缺點:由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水,需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加,也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,而且溶解甲 的有機溶劑對 實驗者也有損害。-2)-2
2.XTT
XTT:化學(xué)名:2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide,作為線粒體脫氫酶的作用底物,被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑(例如 PMS)聯(lián)合應(yīng)用時,其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。
優(yōu)點:1、使用方便,省去了洗滌細(xì)胞;2、檢測快速;3、靈敏度高,甚至可以測定較低細(xì)胞密度;4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。
缺點:XTT水溶液不穩(wěn)定,需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。
K-8法或稱WST-8法
CCK-8
試劑中含有WST–8:化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽],它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物 (Formazan)。生成的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗、細(xì)胞毒性試驗以及藥敏試驗等。
優(yōu)點:1、使用方便,省去了洗滌細(xì)胞,不需要放射性同位素和有機溶劑;2、檢測快速;3、靈敏度高,甚至可以測定較低細(xì)胞密度;4、重復(fù)性優(yōu)于 MTT;5、對細(xì)胞毒性?。?、為1瓶溶液,毋需預(yù)制,即開即用。
缺點:1、與MTT相比,CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色,與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近,不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多 加。
三種方法的比較
 
MTT
XTT
CCK-8法(WST-8法)
甲臜物水溶性
難溶性
水溶性
水溶性
檢測波長
490 nm
450nm
450nm
性狀
粉末
2瓶溶液
1瓶溶液
使用方法
配成溶液后使用
現(xiàn)配現(xiàn)用
毋需預(yù)制
使用有機溶劑
DMSO或其它溶劑
方便性
+
++
+++
檢測速度
+
++
+++
重復(fù)性
+
++
++
穩(wěn)定性
++
+
++
工作量
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對細(xì)胞毒性
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對人體毒性
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