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技術(shù)文章

細(xì)胞活性有哪些測(cè)定方法

閱讀:447發(fā)布時(shí)間:2011-12-20

 

細(xì)胞活性測(cè)定方法
細(xì)胞活性測(cè)定方法有臺(tái)盼藍(lán)染色法、克隆(集落)形成法、3H放射性同位素?fù)饺敕ā?MTT法等。其中MTT法以其快速簡便,不需要特殊檢測(cè)儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測(cè)的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan 為水不溶性的,需要加有機(jī)溶劑溶解,由于在去上清操作時(shí)會(huì)有可能帶走小部分的Formazan,故有時(shí)重復(fù)性略差。為了解決這個(gè)問題,研究人員又開發(fā)了很 多種水溶性的四氮唑鹽類:如XTT、CCK-8(WST-8)等。
現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個(gè)簡單介紹:
1.MTT
MTT:化學(xué)名: 3-(4,5-二甲基噻唑,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名:噻唑藍(lán)。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲 ,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。
缺點(diǎn):由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水,需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加,也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,而且溶解甲 的有機(jī)溶劑對(duì) 實(shí)驗(yàn)者也有損害。-2)-2
2.XTT
XTT:化學(xué)名:2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide,作為線粒體脫氫酶的作用底物,被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑(例如 PMS)聯(lián)合應(yīng)用時(shí),其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。
優(yōu)點(diǎn):1、使用方便,省去了洗滌細(xì)胞;2、檢測(cè)快速;3、靈敏度高,甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度;4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。
缺點(diǎn):XTT水溶液不穩(wěn)定,需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。
K-8法或稱WST-8法
CCK-8
試劑中含有WST–8:化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽],它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物 (Formazan)。生成的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長處測(cè)定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。
優(yōu)點(diǎn):1、使用方便,省去了洗滌細(xì)胞,不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑;2、檢測(cè)快速;3、靈敏度高,甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度;4、重復(fù)性優(yōu)于 MTT;5、對(duì)細(xì)胞毒性??;6、為1瓶溶液,毋需預(yù)制,即開即用。
缺點(diǎn):1、與MTT相比,CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色,與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近,不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多 加。
三種方法的比較
 
MTT
XTT
CCK-8法(WST-8法)
甲臜物水溶性
難溶性
水溶性
水溶性
檢測(cè)波長
490 nm
450nm
450nm
性狀
粉末
2瓶溶液
1瓶溶液
使用方法
配成溶液后使用
現(xiàn)配現(xiàn)用
毋需預(yù)制
使用有機(jī)溶劑
DMSO或其它溶劑
方便性
+
++
+++
檢測(cè)速度
+
++
+++
重復(fù)性
+
++
++
穩(wěn)定性
++
+
++
工作量
---
--
-
對(duì)細(xì)胞毒性
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-
對(duì)人體毒性
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-
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