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上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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放射性免疫分析方法
一、標(biāo)記物制備
(一)*化抗體按文獻(xiàn)Eli方法制備,在雙標(biāo)記IRMA法采用標(biāo)記純化的McAbIgG,在競爭法采用標(biāo)記純化IgG。
(二)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記物采用微量透析法。標(biāo)記的抗體依檢測反應(yīng)模式不同而異。
(三)標(biāo)記物競爭法檢測小分子化合物,標(biāo)記物為抗原,雙標(biāo)記液相IRMA,標(biāo)記物為McAb,標(biāo)記方法按常規(guī)氯胺T氧化法。
二、磁性微粒子固相抗體制備
按照檢測反應(yīng)模式的不同,需要制備不同的磁性微粒子固相抗體],如固相一抗體,固相二抗體。
取直徑800~2000nm 磁性微粒子(表面羧基化),用生理鹽水洗滌。按1O倍量懸浮于生理鹽水中,在緩緩振蕩下加入適量抗體IgG ,立即按IgG對偶聯(lián)劑2O倍(M:M )的量加入碳化二亞胺(EDC),在室溫振蕩下反應(yīng)2h。再補(bǔ)加10倍量的EDC,移至4℃ 反應(yīng)過夜。次晨,再經(jīng)生理鹽水充分洗滌,直至上清液經(jīng)紫外分光光度計(jì)280nm 測量A 值大于0.02。zui后加含有0.5 BSA,0.1ONa N3的25mmol/L pH 7.4 PBS中,4℃保存。
三、IRMA檢測法反應(yīng)模式
(一)雙標(biāo)記FITC 抗FITC 法
將兩株McAb分別標(biāo)記FITC和I,按經(jīng)優(yōu)化的比例混合稀釋液作為標(biāo)記試劑。檢測時(shí),將樣品和標(biāo)記試劑各100ttL加至12×75mm管中,充分混合,放37℃水浴中30~60min,生成夾心免疫復(fù)合物。加入抗FITC磁性微粒子懸浮液100tLL,室溫反應(yīng)5min,置磁性分離器上。傾去管中上清液,用PBS—T洗液0.5mL洗兩次,在自動r計(jì)數(shù)器上按雙對數(shù)或四參數(shù)方程處理測量數(shù)據(jù),即可打印出相關(guān)參數(shù)和待測樣品濃度。
(二)雙標(biāo)記BAS法
該法是將兩株McAb分別標(biāo)記*和I作為標(biāo)記試劑,以磁性微粒子固相為分離試劑。其余同上法。
(三)磁性固相一抗法
此模式和常規(guī)IRMA的實(shí)驗(yàn)原理相同,將兩株McAb分別標(biāo)記I和制備磁性微粒子固相。檢測時(shí),取待測樣品、I—McAb和磁性微粒子McAb懸浮液各100/1L于管中混勻,37℃溫育后,即可在磁性分離器進(jìn)行洗滌分離,去除游離I-McAb,操作雖簡便,但主要缺點(diǎn)是每一檢測項(xiàng)目要單獨(dú)制備磁性微粒子固相抗體,既繁瑣又不經(jīng)濟(jì)。
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