1 原理包被于塑料板上的固相凝聚IgG與酶聯(lián)C1q的結(jié)合受標(biāo)本中免疫復(fù)合物的抑制,是一種競爭性抑制試驗(yàn)。為避免標(biāo)本中內(nèi)源C1q的干擾,應(yīng)預(yù)先用IgG免疫吸附劑將其除去。
2 材料
(1) 聚苯乙烯反應(yīng)板,酶聯(lián)免疫檢測儀。
(2) 免疫吸附劑系結(jié)合有IgG的纖維素。取纖維素(5%,pH值105)與溴化*一起室溫反應(yīng)10min,用01mol/L*緩沖液(pH值80)充分洗滌。再與IgG一起于4℃下作用18h(20ml緩沖液中含3g纖維素和100mg IgG)。制備物用27mol/L*緩沖液(pH值80)配成20%(W/V)懸液,貯于4℃。
(3) 酶聯(lián)C1q用戊二醛法將辣根過氧化物酶標(biāo)記C1q,再經(jīng)超濾AmiconXM200濾膜)分離貯于-20℃。
(4) 其他試劑002mol/L TrisHCl緩沖液(pH值90);02mol/L TrisHCl緩沖液(pH
值7.4),以及含005%Tween20的同一緩沖液;02mol/L EDTA (pH值76);酶底物溶液和中止液。
3 方法
(1) 包被凝聚IgG取經(jīng)002mol/L TrisHCl緩沖液(pH值90)透析過夜的凝聚IgG(100μg/ml),加入聚苯乙烯板孔內(nèi),每孔100μl,37℃包被30min后,用緩沖液洗3次(第1次、第3次用02mol/L TrisHCl緩沖液(pH值74);第2次用含005% Tween20的同一緩沖液) ,真空干燥,貯于4℃。
(2) 取血清標(biāo)本50μl,加入02mol/L EDTA(pH值76)50μl,室溫作用10min,使內(nèi)源C1 q游離,然后加入IgG免疫吸附劑500μl,室溫振蕩20min,再以500r/min離心5min,得到1∶10稀釋的上清液。
(3) 取已包被凝聚IgG的塑料反應(yīng)板,每孔中加入上述上清液90μl,酶聯(lián)C1q10μl(1∶100 ~200稀釋液),室溫下反應(yīng)20min,然后用含02mol/L NaCl,005%Tween20的02mol/L TrisHCl緩沖液(pH值74)洗3次,再加入100μl底物溶液(pH值60、01mol/L磷酸鹽枸櫞酸鹽緩沖液50ml中,加入鄰苯二胺20mg,30%(W/V)過氧化氫10μl),室溫放30min,加入2mol/L硫酸50μl中止反應(yīng),于492nm讀取吸光值。如果定量,可用凝聚IgG制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,測出免疫復(fù)合物的相對含量。