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傳代培養(yǎng)細胞染色體顯示法

時間:2016/1/13閱讀:377
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1)  傳代培養(yǎng)細胞染色體顯示法
1.培養(yǎng)細胞:取處于指數(shù)生長期、用較大瓶皿培養(yǎng)的、80%~90%匯合單層培養(yǎng)細胞。
2.加秋水仙素:使用zui終濃度為0.02~0.8微克/毫升營養(yǎng)液,溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6~10小時;或用低溫封閉法:把培養(yǎng)細胞置于4℃條件下6~12小時后,再于37℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6~10小時處理(加秋水仙素)。
3.采集分裂細胞:可利用分裂中期細胞體變圓與底物附著不牢特點,此時手持培養(yǎng)瓶,左右反復(fù)橫向水平搖動,令培養(yǎng)液在培養(yǎng)細胞表面反復(fù)沖刷。應(yīng)用此法可使90%的中期分裂細胞從瓶壁脫落,注意勿用力過猛,以防多量非分裂細胞脫落影響觀察。
4.離心:收集培養(yǎng)液,1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5~10分鐘。
5.低滲處理:吸除上清液、加入預(yù)溫至37℃的0.075M KCl溶液,在溫箱中靜置20~30分鐘。
6.預(yù)固定:向懸液中加新鮮1:3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打調(diào)勻,此措施能起到先使細胞表面輕微固定,可防止固定后細胞粘連成塊。
7.固定:離心,同4,吸除上清液,加新鮮固定劑5~10ml;加固定劑時要用一手微斜持離心管,另手用吸管吸取固定劑,把固定劑逐滴滴在離心管壁上,使之慢慢流入離心管中,然后輕輕吹打均勻,置15~20分鐘。
8.重復(fù)7,末次離心后,小心吸除大部分上清,據(jù)懸液中細胞密度大小,余下固定液0.5~1ml。
9.制片:用滴片法制片,按如下步驟:*洗凈載物片,勿留任何油脂,置冰箱中儲備備用。滴片前現(xiàn)從冰箱中取出冷載物片1片,在載物片表面出現(xiàn)細微水氣時,立即向片的一側(cè)滴2~3滴細胞懸液,滴片時的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥,或用吹風(fēng)機熱風(fēng)吹干亦可。如此制備好的標本可置盒中備用或立即進行染色觀察。
10.  染色和封片:一般常用Giemsa染色:取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸緩沖液9份混合,染色10分鐘后,水洗、晾干、可直接觀察。如標本需要保存或做長時間觀察,可過二甲苯兩次后,用中性樹膠封片后,再過二甲苯,然后封片亦可。

2)  人末梢血微量全血培養(yǎng)染色體顯示法
1.培養(yǎng)液準備:取15ml培養(yǎng)瓶數(shù)個,每瓶內(nèi)分別充入5ml培養(yǎng)液(pH 7.2),內(nèi)含:1640培養(yǎng)液(含10%~15%小牛血清),PHA 0.1ml,*100單位和*100微克/毫升 培養(yǎng)液
2.抽血針管準備:取2~5ml針管一支,在消毒后的無菌操作臺或無菌操作箱中安裝好注射器,無菌抽肝素(100 U/ml BBS)少許濕潤針管,如動作迅速不用肝素亦可。
3.采血:用棉簽75%酒精給患者或獻血者的皮膚消毒兩次,縛*,靜脈取血1~2ml。無菌操作迅速向每一瓶培養(yǎng)中加血0.4~0.5ml,如系外出采血,安裝針管及分裝血液兩步驟亦可在無菌條件略差的環(huán)境內(nèi)操作,但動作要迅速,以減少污染;在采血量不多或不應(yīng)抽血的情況下,亦可在耳垂、手指肚(無名指)用刺血針采血。
4.培養(yǎng)和加秋水仙素:37℃溫箱中培養(yǎng)到60~72小時之間,此時細胞分裂相zui多,向每培養(yǎng)瓶內(nèi)加秋水仙素,zui終濃度0.02~0.08微克/毫升營養(yǎng)液,再培養(yǎng)4~6小時。
5.低滲:1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,吸除上清液,加入預(yù)溫過的0.075M KCl溶液10ml,置溫箱中低滲處理15~20分鐘。
6.其余步驟與處理傳代細胞法相同。

3)  羊水細胞培養(yǎng)
1.抽取羊水:無菌抽取羊水10~20ml,立即注入無菌離心管中。
2.離心分離:1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,去上清,留0.5ml。
3.培養(yǎng):加培養(yǎng)液4ml(含小牛血清1ml),用NaHCO3調(diào)pH至6.8,置37℃培養(yǎng),在溫箱培養(yǎng)7~10天后,可見大量成纖維細胞或上皮樣細胞生長;加秋水仙素0.02~0.8微克/毫升營養(yǎng)液,作用10~12小時。
4.其余步驟與傳代細胞培養(yǎng)染色體制備法相同。

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