1.組織處理
       恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備的過程中，不僅要求保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
       1） 組織及時取材和固定　
       組織標(biāo)本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵*步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行取材，2h內(nèi)，取材時所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，（也就是說組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊的厚度千萬不能超過0.2cm，否則將不利于組織的均勻固定）。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。
       對于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規(guī)HE病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而HE染色的常規(guī)組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利用其滲透性強(qiáng)，對組織的作用均勻進(jìn)行固定，但組織固定時間在l2h內(nèi)，一般固定時間不應(yīng)超過24小時。隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強(qiáng)度將逐漸降低。
       2） 組織脫水、透明、浸蠟　
       組織經(jīng)固定后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以*脫水和二甲苯透明的時間不宜過長，正常大小的組織*脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過65℃。
       2.切片
       組織得到很好處理后在進(jìn)行切片之前還應(yīng)對玻璃片進(jìn)行處理，由于我們檢測抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時間較長，有些抗原是要進(jìn)行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實驗的正常進(jìn)行，要求在貼片前對載玻片作適當(dāng)處理，必須在清洗干凈的玻片上進(jìn)行粘合劑的處理以防脫片。
       1）Poly-L-Lysine （多聚左旋賴氨酸）　　
       一般采用分子量30000左右的0.5%多聚賴氨酸，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點是可以用于多種組織化學(xué)、免疫組化及分子學(xué)檢測中的應(yīng)用，粘貼效果，但價格稍貴。
       2）明膠硫酸鉻鉀法　
       將2.5g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，*溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如果液體變藍(lán)或粘稠狀停用。
       3）APES （3-氨丙基-乙氧基甲硅烷）　　
       此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。
       切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進(jìn)行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標(biāo)記定位彌漫現(xiàn)象。
       3.免疫組化染色
       S—P免疫組化染色試劑盒采用*標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗*蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗原。
       S—P免疫組化染色步驟：
       1） 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（pH7．4）沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。
       2） 根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。
       3） 每張切片加1滴或50ul過氧化酶阻斷溶液（試劑A），以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10分鐘。
       4） PBS沖洗3×3’。
       5） 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul的非免疫性動物血清（試劑B），室溫下孵育10分鐘。
       6） 甩去血清，每張切片加1滴或50ul的*抗體（用戶自選），室溫下孵育60分鐘或4℃過夜，建議參閱每種抗體的說明書。
       7） PBS沖洗3×5’。
       8） 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul*標(biāo)記的第二抗體（試劑C），室溫下孵育10分鐘。
       9） PBS沖洗3×3’。
       10）甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul鏈霉菌抗*-過氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育10分鐘。
       11）PBS沖洗3×3’。
       12）甩去PBS液，每張切片加2滴或100ul新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3—10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。
       13）自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1％HCL分化，0.1％氨水或PBS沖洗返藍(lán)。
       14）如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，（二甲苯透明），中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。