單克隆抗體制備流程

單克隆抗體制備流程
（一）融合劑
細(xì)胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學(xué)融合法和生物融合法，如仙臺(tái)病毒，此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量為200～700時(shí)，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于1000時(shí)，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，與許多化學(xué)藥品不起作用。用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3調(diào)整），分子量小的PEG，融合效應(yīng)差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50％濃度，pH偏堿時(shí)融合效應(yīng)zui高。也有采用30%～50％濃度的PEG加上10％二甲亞砜。不同批號(hào)的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時(shí)必須注意。每批都必須進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)后方可應(yīng)用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。

（二）融合過程
融合的方法很多，常用的有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法。融合時(shí)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1zui為常用。
1．試劑與材料
（1）供融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞。
（2）1640培養(yǎng)液100ml。
（3）*1640液100ml。
（4）2.5％FCS－1640液50ml。
（5）HAT培養(yǎng)液100ml。
（6）50％PEG：取分子量4000，高純度的（日本進(jìn)口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌，使用前用預(yù)熱于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚紅檢查pH，一般不必調(diào)pH。如pH有改變，可用HCl或NaHCO3調(diào)整。
（7）10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。
（8）40孔塑料培養(yǎng)盤。

單克隆抗體制備
2．操作方法
⑴準(zhǔn)備好脾細(xì)胞。
⑵在50ml沉淀管中混合108脾細(xì)胞和107小鼠骨髓瘤細(xì)胞，并加入50ml2.5％FCS－1640液。
⑶室溫400g離心3min，使細(xì)胞沉淀。
⑷移去上清液。
⑸輕敲管底部，使沉淀流動(dòng)，把沉淀管放于40℃水浴中，使其達(dá)融合溫度。
⑹加預(yù)熱至40℃的50％PEG0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn)，滴加過程要求持續(xù)2min。
⑺加1ml1640液，邊加邊搖動(dòng)，持續(xù)1min。
⑻重復(fù)⑺一次。
⑼加1ml1640液，邊加邊搖動(dòng)，持續(xù)0.5min。
⑽重復(fù)⑼一次。
⑾加1640液15ml。
⑿室溫，400g離心1min，使細(xì)胞沉淀。
⒀去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的*1640液。
⒁往已于前一日種有飼養(yǎng)細(xì)胞的40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融合的細(xì)胞液，每孔1滴（約0.05ml）。
⒂輕搖后，放入5％CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
⒃第3、6、9、10日換入含HAT的*1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞。
⒄于第12、15日加入含有HAT的*1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)出來。大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在10~20天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在1個(gè)月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體。
⒅對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和*1640液而代之以10%FCS－1640液。同時(shí)保存于液氮和進(jìn)行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟失。

（三）細(xì)胞融合的關(guān)鍵
1．技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。
２．融合試驗(yàn)zui大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術(shù)。