梅毒螺旋體的檢測方法及評價

梅毒螺旋體（treponemapallidum,TP）是引起性傳播性疾病梅毒的主要病原體。1905年由Schandim等發(fā)現(xiàn),通過人類粘膜或有破損的皮膚直接接觸病人感染性病灶而傳播。不但引起人類全身性疾病危害人們的健康,同時還傳播給下一代。多年來通過大量的研究工作,建立了許多檢測TP的方法。近年來,隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展,進(jìn)一步促進(jìn)了對TP的研究工作,使得快速、敏感、特異的梅毒診斷方法不斷更新完善,有利于廣泛開展流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防控制及更準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床治療。
TP檢測的各種方法
檢測TP和抗-TP抗體的方法有梅毒螺旋體檢查和血清學(xué)檢查法。梅毒螺旋體檢查主要包括暗視野顯微鏡檢查、直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（ＤＦＡ）及梅毒螺旋體鍍銀染色檢查,其中ＤＦＡ的特異性較高。梅毒螺旋體檢查適用于一、二期梅毒有病損者的患者，受取材及特殊顯微鏡限制，耗時長,難以為臨床所接受。
血清學(xué)試驗(yàn)是目前國內(nèi)外診斷梅毒的主要方法,其種類較多,包括非螺旋體抗原試驗(yàn)（非特異性試驗(yàn)）和螺旋體抗原試驗(yàn)（特異性試驗(yàn)）。
非特異性試驗(yàn)是以類脂質(zhì)為抗原的試驗(yàn)方法,世界衛(wèi)生組織確認(rèn)診斷梅毒的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)有
1性病研究實(shí)驗(yàn)室（VDRL）試驗(yàn);
2不加熱血清反應(yīng)素（USR）實(shí)驗(yàn);
3快速血漿反應(yīng)素（RPR）試驗(yàn);
4自動反應(yīng)素（ART）試驗(yàn);
5 RST反應(yīng)素篩選試驗(yàn)和TRUSAT（甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)）。這些試驗(yàn)因具有相同的標(biāo)準(zhǔn)化抗原,敏感性相似,對1、2期梅毒有診斷價值,也可做療效隨訪用。又因其操作簡易,費(fèi)用低廉,常用作梅毒的篩選檢查。但它們的敏感性和特異性比特異試驗(yàn)差,并且生物學(xué)假陽性高,結(jié)果受多種條件的影響。除對其他螺旋體感染時出現(xiàn)陽性外,假陽性還出現(xiàn)在急、慢性感染,妊娠,高丙種球蛋白血癥,結(jié)締組織病,溶血性貧血和其他自身免疫性疾病,也可出現(xiàn)在老年人和一些健康人,但多數(shù)情況下查不出原因。在國外上述幾種非特異性試驗(yàn)中,除VDRL試驗(yàn)常用外,RPR試驗(yàn)和ART應(yīng)用較少。
在我國多用RPR和TRUST。就TRUST、RPR兩種方法而言,對非特異性反應(yīng)素抗體導(dǎo)致的陽性標(biāo)本TRUST法的檢出率和重復(fù)性都強(qiáng)于RPR法,這可能與TRUST試劑中表面包裹抗原的甲苯胺紅顆粒比RPR試劑中的活性炭顆粒小更易耐受振蕩導(dǎo)致TRUST試劑穩(wěn)定性強(qiáng)有關(guān)。
特異性試驗(yàn)是以梅毒密螺旋體本身或非致病的密螺旋體為抗原,以檢查病人血清中抗密螺旋體的特異性抗體。目前應(yīng)用的方法有:
1密螺旋體熒光抗體吸收（FTA-ABS）試驗(yàn); FTA-ABS試驗(yàn)被認(rèn)為是當(dāng)前敏感性和特異性zui高的試驗(yàn)方法, 且在1期梅毒頭幾天就可以測出特異性抗體F3G，常用來zui后確診梅毒,在研究中以它為標(biāo)準(zhǔn)。但提取物為活菌，存在潛在危險性，故其應(yīng)用受到很大限制。FAT-ABS試驗(yàn)是定性試驗(yàn),治療對它的影響也很小,一般用于確診而不用于篩選。
2梅毒密螺旋體血凝（TPHA）試驗(yàn); TPHA試驗(yàn)容易操作和定量,特異性高,但試劑昂貴和不易標(biāo)準(zhǔn)化,偶然發(fā)生生物學(xué)假陽性。
通過對國內(nèi)文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn)，近年來TPHA已成為對除FTA-ABS以外的其他實(shí)驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
3蛋白印跡試驗(yàn); 免疫印跡法檢測梅毒特異性抗體敏感度等于或高于其它三種同類方法,特異性與ELISA和TPPA兩種方法相同,但顯著高于FTA-ABS法（92.2%）。免疫印跡法敏感度高,特異性好,操作簡單,不需特殊儀器設(shè)備,陰陽性結(jié)果界線分明,易于判斷,適應(yīng)于臨床廣泛開展。
蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)合了免疫學(xué)和分子生物學(xué)的特點(diǎn),敏感性高,特異性強(qiáng)。
梅毒螺旋體的檢測方法及評價
4 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗(yàn); ELISA法采用抗原包被,用過氧化物酶標(biāo)記并進(jìn)行酶反應(yīng),是一種較新的梅毒診斷血清學(xué)方法。用抗梅毒特異性抗體ELISA試劑盒檢測梅毒抗體,*代試劑原理為間接法,采用梅毒抗原包被在酶標(biāo)板上, 以辣根過氧化酶標(biāo)記物的抗人-IgG為第二抗體,測定梅毒感染的特異性抗體,據(jù)報道ELISA法對梅毒感染的整體敏感性達(dá)98%以上,特異性達(dá)99%,可與TPHA,FTA-ABS試驗(yàn)媲美。但梅毒患者血清存在IgG、IgM 二種抗體，應(yīng)同時檢測，以提高敏感度。國外有報道：ELISA IgG敏感性一期梅毒為82%，其余各階段均為100%，假陽性1.5%；               ELISA IgM陽性率一期梅毒為 94%，二期梅毒為85%，早期潛伏梅毒為82%。因此認(rèn)為分別作ELISA IgM和ELISA IgG是確診梅毒的一種有效而簡單的方法。國內(nèi)有人同時檢測特異性IgG和IgM抗體，其陽性率分別為一期梅毒93.8%，二期梅毒100%（IgG/IgM抗體試劑由意大利公司提供）。
第二代抗TP-ELISA試劑使用雙抗體夾心法，主要是用基因重組表達(dá)抗原,包括梅毒螺旋體4種膜抗原,然后進(jìn)行混合使用。用ELISA方法檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TPHA的總符合率為99 3%,且此方法操作簡便,一次可完成多份標(biāo)本的檢測,試驗(yàn)結(jié)果由儀器分析,客觀而準(zhǔn)確。
現(xiàn)在的梅毒抗體診斷試劑將各區(qū)優(yōu)勢抗原連接成一個多表位的嵌合抗原,這樣表達(dá)的多表位抗原即可滿足診斷試劑的需要,大大提高了檢測試劑的靈敏度。隨著抗原表位的增多,檢測的靈敏度也隨之提高。以Ｔｐ15 17 42 47的四合一重組抗原為基礎(chǔ)的診斷試劑是用于抗Ｔｐ ＥＬＩＳＡ的多表位抗原。
但有的TP-ELISA試劑,該試劑盒質(zhì)量差，有文獻(xiàn)報道蘭州生物制品研究所的梅毒螺旋體特異性抗體酶標(biāo)目測試劑盒與TPHA對比試驗(yàn),二者符合率45.5%,35例梅毒血清中僅6例呈TP-ELISA陽性,其陽性檢出率為17.1%。此6例TP-ELISA陽性者的TPHA結(jié)果,滴度均在1∶160以上,而TPHA1∶80陽性者無一例TP-ELISA陽性。敏感性極差。
有研究表明:用免疫印跡法、熒光梅毒螺旋體抗體吸附實(shí)驗(yàn)（FTA-ABS）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）和梅毒螺旋體被動明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)（TPPA） 四種方法結(jié)果相比較。結(jié)果44例未經(jīng)治療的梅四種方法檢測治療前后梅毒患者結(jié)果一致性分別為100%和92.8%,四種方法檢測梅毒的敏感度分別為100%,98.3%,98.3%,100%,經(jīng)卡方檢驗(yàn),四種方法檢測敏感度差異無顯著性意義（P>0.05）。
5聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試驗(yàn)。
PCR法是目前的檢驗(yàn)技術(shù)之一,直接檢測TP的DNA物質(zhì),敏感特異,但PCR方法在普通實(shí)驗(yàn)室操作中容易造成PCR污染,且僅用于檢測病原,故并不能取代梅毒血清學(xué)檢測方法。
6膠體金免疫層析法（GICA）、金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法（DIFA）。
使用膠體金作為標(biāo)記物的一種固相膜免疫測定方法,檢測梅毒特異性抗體,采用了雙抗夾心法。二期梅毒、三期梅毒、晚期潛伏梅毒的陽性試驗(yàn)符合率為100%,在一期梅毒中的敏感度為80%～85%,對早期梅毒的敏感性均較差。 各檢測方法在臨床上的使用
TP檢驗(yàn)方法的應(yīng)用由于目前已獲得特異性抗原的基因工程重組蛋白的純制品,使得當(dāng)前對梅毒的診斷仍能以血清學(xué)試驗(yàn)為可靠的依據(jù),但因試用于臨床診斷時間尚短,仍應(yīng)結(jié)合病史和全面地體格檢查,而做出診斷。
篩選應(yīng)用　一般認(rèn)為感染梅毒后可檢出陽性結(jié)果的試驗(yàn)順序通常是FTA-ABS試驗(yàn)→非特異性試驗(yàn)→TPHA試驗(yàn),但在以早期診斷為目的情況下,可以幾種方法同時進(jìn)行,常用的是一種或兩種非特異性試驗(yàn)和一種特異性試驗(yàn)聯(lián)合檢查,一般選用VDRL和RPR試驗(yàn)與TPHA試驗(yàn)配合應(yīng)用。
證實(shí)試驗(yàn)應(yīng)用　使用FTA-ABS試驗(yàn)。由于血凝法技術(shù)的進(jìn)展,如MHA-TP試驗(yàn)也可用于確診,但其敏感性介于非特異性試驗(yàn)和FTA-ABS試驗(yàn)之間。
ELISA也有可作為梅毒的確診試驗(yàn)。觀察病情和治療反應(yīng)的作用　早期梅毒經(jīng)治療后,非特異性的反應(yīng)素滴度一般下降很快,特異性試驗(yàn)中FTA-ABS試驗(yàn)的陽性反應(yīng)（不能觀察滴度的變化）可保留一段時間
而在TPHA試驗(yàn)雖然病人經(jīng)過充分治療并顯示臨床上的成功,但試驗(yàn)的陽性反應(yīng)仍能持續(xù)相當(dāng)長時間,甚至終身陽性。
免疫印跡技術(shù)和PCR診斷有癥狀的先天性梅毒時,具有高度敏感性和特異性,但對無癥狀的嬰兒診斷時需慎重,應(yīng)考慮存在非特異性的抗體反應(yīng)。PCR可取代RST作為診斷先天性及神經(jīng)性梅毒常用方法。
綜上所述，對血清學(xué)試驗(yàn)選擇，應(yīng)選用TPHA、TPPA法進(jìn)行過篩試驗(yàn)，陽性者用PST-ABS等法作確認(rèn)試驗(yàn)。RPR、TRUST可將標(biāo)本進(jìn)行稀釋進(jìn)行半定量試驗(yàn)，可以作為療效評價及判斷是否再次感染試驗(yàn)。。ELISAS應(yīng)作IgG、IgM抗體檢測以提高敏感度。ICKD、                          LCMD 法假陰、陽性多，但方法簡單、快速，可作為普查用。
梅毒診斷一度僅依賴于暗視野顯微鏡檢查和敏感性、特異性均低的一般血清學(xué)試驗(yàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展,聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡技術(shù)為梅毒的診斷提供了新的檢測手段。特別是在早期梅毒、先天性及神經(jīng)性梅毒診斷中顯示了較高的敏感性和較強(qiáng)的特異性。梅毒診斷方法的發(fā)展和完善,有利于指導(dǎo)臨床及時治療。