1、 包拉米蟲感染熒光PCR檢測試劑盒簡介
貨號：HB-910
本試劑盒采用熒光PCR技術(shù)，檢測組織樣品總DNA中包拉米蟲DNA。本試劑盒采用特異性的引物和
探針擴增目的基因，并制備了陽性對照用于結(jié)果判定，通過優(yōu)化的反應(yīng)體系，能夠zui大限度地檢測
包拉米蟲核酸。
2、試劑盒組成
試劑盒組成包括*和核酸擴增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
組成成分 體積
樣品 DNA 提取液 1
樣品 DNA 提取液 2
5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
包拉米蟲熒光 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對照
包拉米蟲熒光 陽性對照
5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。
3、樣本采集，存放及運輸
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。按相關(guān)檢測標準*的方法，取貝類組
織30mg標記后置于離心管中,按照試劑盒配套的DNA提試劑操作說明提取DNA模板。
3.2存放：研磨后的樣本在2 ℃-8 ℃條件下保存應(yīng)不超過24 h；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避免
反復(fù)凍融（zui多凍融3次）。
3.3 運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、檢測步驟
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進行)：
4.1.1 取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個管進行
編號標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃條件下，2 000 r/min 離心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
4.2包拉米蟲感染熒光PCR檢測試劑盒 熒光 PCR 檢測
4.2.1 擴增試劑準備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的 KHV 熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應(yīng)
體系配制見下表 2。
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進行）：
向每個熒光 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL，蓋緊管蓋，
500 r/min 離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）：
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段，94℃/3 min；
第二階段，92℃/15 sec，53℃/15 sec，60 o
C/30s ，40個循環(huán)，在每次循環(huán)的60o
C延伸時收集
熒光。試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。
5、結(jié)果判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴增曲線的zui高點為準。
5.2 質(zhì)控標準
5.2.1 陰性對照無 Ct 值或無擴增曲線。
5.2.2 陽性對照的 Ct 值應(yīng)<28.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為無效。
5.3 結(jié)果描述及判定
5.3.1 陰性：無Ct值或無擴增曲線，示樣品中無包拉米蟲核酸。
5.3.2 陽性：Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，示樣品中存在包拉米蟲核酸。
5.3.3 有效原則：Ct>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。
6、包拉米蟲感染熒光PCR檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)信息
Taqman 探針：5'-FAM-TTAGGTGGATAAGAGCCGC-MGBNFQ-3'
上游引物 F：5'-CCCTGCCCTTTGTACACACC-3'
下游引物 R：5'-TCACAAAGCTTCTAAGAACGCG-3'
